發(fā)布時間：2019-09-24 00:09

【摘要】：目的：建立穩(wěn)定的體外正常大鼠腎細胞(NRK cells)缺血再灌注模型,尋找建立模型的最佳條件,并驗證大鼠Ppif基因在缺血再灌注模型中的表達；研究siRNA對大鼠Ppif基因的抑制作用；構(gòu)建pGCL-Ppif即介導(dǎo)大鼠Ppif基因沉默的慢病毒載體轉(zhuǎn)移質(zhì)粒,為進一步包裝pGCL-Ppif慢病毒載體奠定基礎(chǔ)；觀察抑制大鼠Ppif基因的表達對缺血再灌注損傷腎臟的保護作用,并探討其作用機制。 方法：(1)體外培養(yǎng)正常大鼠腎細胞(NRK cells),以氧糖剝奪(krebs)液及使用去氧劑連二亞硫酸鈉(Na2S204)來模擬體外正常大鼠腎細胞(NRK cells)缺血再灌注,Annexin V/PI染色后,流式細胞儀檢測正常大鼠腎細胞(NRK cells)凋亡率,用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)方法檢測Ppif基因(CypD的編碼基因)的mRNA表達。(2)根據(jù)大鼠Ppif基因序列設(shè)計并化學(xué)合成3對siRNA及1對陰性對照siRNA,并在5'端標記FAM羧基熒光素,以脂質(zhì)體Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染入正常大鼠腎細胞(NRK cells),用RT-PCR和Westernblot分別檢測其在正常大鼠腎細胞(NRK cells)中的Ppif基因和蛋白表達量的改變、驗證所設(shè)計的siRNA的抑制效應(yīng)。(3)以大鼠Ppif基因為靶基因,根據(jù)核糖核酸干擾(ribonucleic acid interfere, RNAi)序列設(shè)計原則,設(shè)計4對有小發(fā)夾結(jié)構(gòu)的RNAi靶點序列,退火形成雙鏈DNA,雙酶切后定向克隆到慢病毒載體轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pGCL-Ppif中,構(gòu)建4個含靶基因片段的pGCL-Ppif即重組慢病毒載體轉(zhuǎn)移質(zhì)粒并對該基因的質(zhì)粒進行測序鑒定及PCR鑒定。(4)建立SD大鼠腎缺血再灌注模型,將實驗動物隨機分為3組：空白組、陰性對照組、治療組(各20只)。治療組大鼠給Ppif基因靶向核糖核酸干擾(ribonucleic acid interfere, RNAi)慢病毒載體(4 ug/g)0.3 mL,陰性對照組再灌注時給予0.3 mL含體積分數(shù)0.01DMSO的生理鹽水,空白組不夾閉腎蒂,余處理同陰性對照組。分別檢測各組血肌酐(Cr)含量、細胞凋亡指數(shù)(AI)、尿素氮(BUN)含量、HE染色組織病理學(xué)分析。 結(jié)果：(1)去氧去糖40 mmin再復(fù)氧復(fù)糖后,正常大鼠腎細胞(NRK cells)凋亡率于16h達到最高值(P0.05)。Ppif mRNA在再復(fù)氧0 h時,Ppif mRNA有基礎(chǔ)水平的表達,4 h開始升高,8 h時表達水平明顯升高,隨再灌注時間延長,表達量逐漸增高,再灌注16 h時達高峰,48 h開始回落,各時段與0 h比較,均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；(2)以脂質(zhì)體Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染所設(shè)計的siRNA進入正常大鼠腎細胞(NRK cells),轉(zhuǎn)染效率90%。起始于405、556位點的siRNA在正常大鼠腎細胞(NRK cells)基因水平對Ppif無明顯抑制效應(yīng)(P0.05)；起始于198位點的siRNA正常大鼠腎細胞(NRK cells)在基因和蛋白水平均有明顯的抑制效應(yīng),基因水平下降75.25%(P0.05)；蛋白水平下降72.13%P0.05)；(3)Ppif的短發(fā)夾RNA (small hairpin ribonucleic acid,shRNA)片段被成功克隆到pGCL-GFP慢病毒載體轉(zhuǎn)移質(zhì)粒中,并且4個插入的序列與我們之前設(shè)計的靶基因片段是一致的；(4)治療組與陰性對照組比較,血BUN和Cr均明顯降低,細胞凋亡指數(shù)(AI)明顯下降,且有顯著性差異(P0.05),HE染色組織病理學(xué)分析結(jié)果顯著。 結(jié)論：(1)本模型可以模擬正常大鼠腎細胞(NRK cells)體內(nèi)缺血再灌注機制,去氧去糖40 min后再復(fù)氧復(fù)糖16 h是體外正常大鼠腎細胞(NRK cells)缺血再灌注誘導(dǎo)凋亡的最佳條件,并驗證了正常大鼠腎細胞(NRK cells)在缺氧再灌注模型中Ppif基因的表達。(2)起始于198位點的siRNA對正常大鼠腎細胞(NRK cells)的Ppif基因有明顯的抑制效應(yīng)。(3)成功的構(gòu)建了慢病毒載體轉(zhuǎn)移質(zhì)粒,能夠表達4個含Ppif靶基因片段,并且為進一步包裝慢病毒載體(介導(dǎo)Ppif基因沉默)奠定了基礎(chǔ)。(4)Ppif基因靶向RNAi慢病毒載體可以有效的抑制Ppif基因的表達,從而抑制線粒體的凋亡,減輕大鼠腎臟缺血再灌注損傷。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R363

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本文編號：2540557