【摘要】： 目的:(1)探討弓形蟲(chóng)速殖子體外培養(yǎng)、凍存和純化的方法,為后續(xù)開(kāi)展弓形蟲(chóng)的相關(guān)研究提供豐富而純化的速殖子。(2)比較5種常用弓形蟲(chóng)速殖子DNA提取方法,為后續(xù)實(shí)驗(yàn)弓形蟲(chóng)速殖子DNA提取篩選高效簡(jiǎn)便的方法。(3)建立和優(yōu)化LAMP反應(yīng)體系,為弓形蟲(chóng)病的診斷建立一種靈敏度高、特異性強(qiáng)、簡(jiǎn)單快速的弓形蟲(chóng)DNA檢測(cè)方法。 方法:(1)將弓形蟲(chóng)速殖子接種至Hela細(xì)胞,動(dòng)態(tài)觀察速殖子在Hela細(xì)胞中增殖的體外培養(yǎng)過(guò)程。(2)速殖子中加入7%二甲亞砜和15%的乙二醇于-76℃凍存,觀察6個(gè)月內(nèi)兩種防凍劑對(duì)速殖子的凍存保護(hù)效果。(3)比較3、5、8μm3種規(guī)格的濾膜對(duì)體內(nèi)外培養(yǎng)的速殖子的純化效果。(4)分別以試劑盒法、直接裂解法、煮沸法、酚-氯仿法和鹽析法提取10倍系列稀釋的弓形蟲(chóng)速殖子DNA,通過(guò)分光光度計(jì)、瓊脂糖凝膠電泳和PCR比較其效果。(5)采用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)建立了檢測(cè)弓形蟲(chóng)DNA的方法,并對(duì)反應(yīng)體系進(jìn)行了優(yōu)化,在此基礎(chǔ)上進(jìn)行特異性、敏感性評(píng)估,并與傳統(tǒng)PCR進(jìn)行了比較。 結(jié)果:(1)弓形蟲(chóng)速殖子能在Hela細(xì)胞中較好的生長(zhǎng)增殖,并且在96～144h增殖達(dá)到高峰,這個(gè)時(shí)間段收集速殖子產(chǎn)量較高,Hela細(xì)胞基本被破壞,含Hela細(xì)胞較少。(2)用7%二甲亞砜和15%的乙二醇-76℃凍存速殖子,第1個(gè)月末兩者防凍效果沒(méi)有明顯差異(P 0.05),第3個(gè)月末和第6個(gè)月末7%二甲亞砜的防凍效果優(yōu)于15%的乙二醇(P0.05)。隨著時(shí)間的推移速殖子的存活率下降,但在6個(gè)月末兩種方法凍存的速殖子都能成功感染小鼠。(3)在體內(nèi)培養(yǎng)的速殖子純化時(shí),3、5、8μm3種規(guī)格的濾膜對(duì)白細(xì)胞的清除率無(wú)差別(P 0.05);對(duì)紅細(xì)胞的清除率隨濾膜孔徑的增加而降低,三者之間具有顯著差異(P0.05);速殖子的回收率隨孔徑的增加而增加,三者間具有顯著差異(P0.05)。在體外培養(yǎng)的速殖子純化時(shí),3、5、8μm3種規(guī)格的濾膜對(duì)Hela細(xì)胞的清除率無(wú)差別(P 0.05),速殖子的回收率隨孔徑的增加而增加,三者間具有顯著差異(P0.05)。(4)酚-氯仿法提取的DNA純度最高,煮沸法、鹽析法、直接裂解法和試劑盒法依次降低;瓊脂糖凝膠電泳可檢測(cè)出由直接裂解法、酚-氯仿法、鹽析法提取1×106個(gè)速殖子的基因組DNA;試劑盒法、直接裂解法、煮沸法、酚-氯仿法、鹽析法提取的DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增可檢測(cè)最少速殖子的數(shù)量依次為1×104 ,無(wú)目的條帶,1×102,1×101,1×103個(gè)。(5)通過(guò)對(duì)建立的LAMP擴(kuò)增弓形蟲(chóng)DNA反應(yīng)體系的優(yōu)化,發(fā)現(xiàn)25μl體系以1.2 mM dNTPs,6mM MgSO4,8U Bst DNA聚合酶為佳,反應(yīng)溫度在63℃為佳,反應(yīng)時(shí)間可根據(jù)需要選擇30～60min之間,用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)未能發(fā)現(xiàn)加入環(huán)引物能加快反應(yīng)溫度。甜菜堿對(duì)反應(yīng)影響不大。特異性評(píng)估表明僅弓形蟲(chóng)檢測(cè)陽(yáng)性。LAMP的靈敏度比常規(guī)PCR高10倍,即每毫升可檢測(cè)到個(gè)位數(shù)的速殖子數(shù)。在檢測(cè)弓形蟲(chóng)感染小鼠組織標(biāo)本時(shí),兩者特異性無(wú)差別。除瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)反應(yīng)結(jié)果外,還可以通過(guò)比濁儀,離心后肉眼觀察沉淀及加入熒光染料后在紫外燈下觀察LAMP結(jié)果。 結(jié)論:Hela細(xì)胞可用于弓形蟲(chóng)速殖子的體外培養(yǎng)增殖,速殖子在加入防凍劑的情況下可在-76℃冰箱保存半年以上,可以根據(jù)后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇不同孔徑的濾膜用于弓形蟲(chóng)速殖子的純化。經(jīng)典的酚-氯仿法體取速殖子DNA純度高,但操作比較繁瑣,直接煮沸法操作方便,能滿足一般實(shí)驗(yàn)對(duì)DNA的提取要求。本研究建立的LAMP檢測(cè)弓形蟲(chóng)基因組DNA方法,特異性強(qiáng)、敏感性高、簡(jiǎn)便快速且成本低,通過(guò)不斷的改進(jìn),有望成為一種新的診斷弓形蟲(chóng)的方法。
【圖文】：

10圖 1-1 速殖子侵入 Hela 細(xì)胞動(dòng)態(tài)觀察 （×400）A:正常 Hela 細(xì)胞 B：速殖子侵入 Hela 細(xì)胞 4hC:速殖子侵入 Hela 細(xì)胞 24h D:速殖子侵入 Hela 細(xì)胞 48hE:速殖子侵入 Hela 細(xì)胞 96h F:速殖子侵入 Hela 細(xì)胞 144hFig.1-1 Continual observation of tachyzoites infecting Hela cell（×400）A:Normal Hela cell B: Hela cell infected with tachyzoites after 4hC: Hela cell infected with tachyzoites after 24h

D: Hela cell infected with tachyzoites after 48hE: Hela cell infected with tachyzoites after 96hF: Hela cell infected with tachyzoites after 144h2.2 小鼠腹水中弓形蟲(chóng)速殖子的形態(tài)觀察腹水中速殖子經(jīng)瑞氏（圖 1-2A）和瑞氏-吉姆薩(圖 1-2B)染色，可見(jiàn)蟲(chóng)體在腹水中分散存在或排列成菊花狀，被速殖子侵入的細(xì)胞，胞漿破裂，速殖子圍繞于核周。
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類(lèi)號(hào)】：R382.5

【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 劉明如;弓形蟲(chóng)單克隆抗體的制備及生物學(xué)活性的初步鑒定[D];廣西大學(xué);2012年

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本文編號(hào)：2539270