【摘要】： 目的:構(gòu)建缺失300-444位氨基酸的干擾素β啟動刺激因子1(Interferon beta promoter stimulator 1, IPS-1)的突變體基因(△IPS-1基因)及其重組質(zhì)粒pEF-BOS-FLAG/△I PS-1,通過體外細胞實驗初步研究△I PS-1對IFN-β誘生作用及其抗HSV-1作用的影響,進而確定該部位對IPS-1發(fā)揮正常功能的作用,為進一步探索IPS-1蛋白的生物學(xué)活性提供實驗依據(jù)。 方法:以含有IPS-1目的基因的重組質(zhì)粒(pEF-BOS-FLAG/IPS-1)為模板,用Primer5.0軟件設(shè)計引物,通過重疊延伸PCR法獲得缺失300-444位氨基酸的△I PS-1基因,經(jīng)酶切純化后將△I PS-1基因克隆至pEF-BOS-FLAG真核表達載體;陽性克隆經(jīng)雙酶切及測序鑒定。采用磷酸鈣體外轉(zhuǎn)染至HEK293T細胞株,經(jīng)Western-blot檢測其表達;分別用IPS-1及△I PS-1刺激細胞后,ELISA檢測不同時間點細胞培養(yǎng)上清中IFN-β分泌量;用不同感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection, MOI)的HSV-1病毒感染分別轉(zhuǎn)染了pEF-BOS-FLAG/IPS-1、pEF-BOS-FLAG/△I PS-1質(zhì)粒的HEK293T細胞,氨基黑染色法檢測不同組別中細胞感染病毒后的細胞病變效應(yīng)(cytopathic effect, CPE);噬菌斑檢測各轉(zhuǎn)染細胞組不同時間段細胞上清的病毒滴度。 結(jié)果:成功構(gòu)建了△IPS-1基因及pEF-BOS-FLAG/△I PS-1真核表達載體,雙酶切鑒定及測序結(jié)果顯示目的片段與△I PS-1基因序列完全一致;將真核表達載體pEF-BOS-FLAG/△I PS-1及pEF-BOS-FLAG/IPS-1分別轉(zhuǎn)染HEK293T細胞,48h后進行Western-blot鑒定,可分別檢測到分子量約為44.2kD和58.8kD的蛋白條帶,與預(yù)期的△IPS-1及IPS-1大小一致。pEF-BOS-FLAG/△IPS-1、pEF-BOS-FLAG/IPS-1轉(zhuǎn)染組細胞培養(yǎng)上清中不同時間段IFN-β的分泌量明顯高于空白對照組(P0.001);與轉(zhuǎn)染了pEF-BOS-FLAG/IPS-1重組質(zhì)粒細胞組相比轉(zhuǎn)染了pEF-BOS-FLAG/△IPS-1重組質(zhì)粒細胞組在不同時間段其IFN-β分泌量均有明顯減少,兩組相比有統(tǒng)計學(xué)差異(P均0.05)。氨基黑染色測定結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染了pEF-BOS-FLAG/△I PS-1重組質(zhì)粒的細胞組中發(fā)生CPE的細胞比例高于pEF-BOS-FLAG/IPS-1重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細胞組。病毒滴度檢測結(jié)果表明轉(zhuǎn)染了pEF-BOS-FLAG/△I PS-1重組質(zhì)粒的細胞上清中病毒滴度高于轉(zhuǎn)染了pEF-BOS-FLAG/IPS-1重組質(zhì)粒組,且兩組病毒滴度均低于空白對照組。 結(jié)論: (1)構(gòu)建了IPS-1基因缺失300-444位氨基酸的△I PS-1基因及重組質(zhì)粒pEF-BOS-FLAG/△IPS-1。 (2)缺失300-444位氨基酸的△IPS-1與IPS-1相比能使HEK293T細胞IFN-β分泌量明顯減少,△IPS-1不能完全抑制HSV-1感染細胞產(chǎn)生的細胞病變效應(yīng),該突變體抗HSV-1病毒作用明顯減弱。
【圖文】：

IPS-1 基因 PCR 產(chǎn)物瓊脂糖電；2：PCR 產(chǎn)物 AD（△ I PS-1tic analysis of PCR product 1.0% agarose geloduct of AD fragment（ △I PS-1切鑒定及 PCR 鑒定用 XbaⅠ和 ClaⅠ雙酶切后接，轉(zhuǎn)化感受態(tài) E.coli DH5裂解法抽提重組質(zhì)粒，用 的片段。用抽提的重組質(zhì)粒 圖 4）。

變體 IPS-1 基因 PCR 產(chǎn)物瓊脂糖電泳對照；2：PCR 產(chǎn)物 AD（△ I PS-1 基horetic analysis of PCR product of nt) by 1.0% agarose gelR product of AD fragment（ △I PS-1 ge酶切鑒定及 PCR 鑒定 產(chǎn)物用 XbaⅠ和 ClaⅠ雙酶切后，向連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài) E.coli DH5α 受，，堿裂解法抽提重組質(zhì)粒，用 Xbabp 目的片段。用抽提的重組質(zhì)粒 DN段（圖 4）。
【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R392.1

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1 馬安;IPS-1基因缺失突變體對IFN-β誘生作用及其抗HSV-1作用的影響[D];南華大學(xué);2008年

2 劉琴;豬DDX3X的功能分析及其對豬繁殖與呼吸綜合征病毒增殖的影響[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2011年

本文編號：2537441