【摘要】： 結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteria tuberculosis)是引起結(jié)核病的病原體。耐藥結(jié)核病的傳播和耐藥結(jié)核病在艾滋病(AIDS)病人中多次爆發(fā)流行導(dǎo)致結(jié)核病疫情在全球范圍出現(xiàn)回升局面,而現(xiàn)有的抗結(jié)核藥物不能有效地治愈結(jié)核病,導(dǎo)致結(jié)核病患者的死亡率顯著增加。因此,迫切需要研發(fā)有效的抗結(jié)核新藥。 結(jié)合分枝桿菌的細(xì)胞壁在其生存和增殖過程中起著重要的作用,其核心結(jié)構(gòu)由肽聚糖、阿拉伯半乳聚糖、分枝菌酸三種組分連接組成。被分枝菌酸脂化的聚阿拉伯糖與聚半乳糖通過銜接雙糖(L-鼠李糖-D-N-乙酰葡糖胺)共價連接到肽聚糖分子上。在肽聚糖和二糖連接分子中共有的組成成分是N-乙酰葡糖胺,因此,影響N-乙酰葡糖胺合成的因素都可作為新藥的理想靶標(biāo)。 根據(jù)生物信息學(xué)的比對,發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌Rv1018c編碼的蛋白質(zhì)與大腸桿菌的GlmU蛋白有一定的同源性(37%)。大腸桿菌中的GlmU是一種雙功能酶,在UDP-N-乙酰葡糖胺的合成過程中催化了兩步連續(xù)的反應(yīng):(1)催化葡糖胺-1-磷酸生成N-乙酰葡糖胺-1-磷酸;(2)催化N-乙酰葡糖胺-1-磷酸生成終產(chǎn)物UDP-N-乙酰葡糖胺,UDP-N-乙酰葡糖胺作為N-乙酰葡糖胺的糖基供體,參與肽聚糖和二糖連接分子的形成。為了鑒定結(jié)核分枝桿菌Rv1018c (glmU)的功能,我們首先要克隆編碼結(jié)核分枝桿菌的Rv1018c(glmU)基因,然后利用大腸桿菌高效表達(dá)Tb GlmU蛋白,利用酶促反應(yīng)法鑒定Tb GlmU蛋白的功能。本論文的目的是: (1)用PCR方法擴(kuò)增出正確的目的Tb glmU基因;(2)將Tb glmU基因克隆到pBluescript II KS(-)克隆載體中,經(jīng)DNA序列測定證實為正確的基因;(3)將Tb glmU基因克隆到pET16b表達(dá)載體中并通過大腸桿菌BL21(DE3)中表達(dá)Tb GlmU蛋白;(4)用親和層析法純化重組GlmU蛋白,并用Western Blotting方法鑒定Tb GlmU蛋白;(5)用高效液相色譜法鑒定Tb GlmU的雙功能酶活性。 本論文所獲得的結(jié)果如下: 1.用PCR方法對目的基因Tb glmU的擴(kuò)增 從結(jié)核分枝桿菌H37Rv菌株基因組數(shù)據(jù)庫(http://geno- list.pasteur.fr./TubercuList/)中獲得Tb glmU基因的核苷酸序列(1488bp)。根據(jù)其核苷酸序列設(shè)計一對PCR引物,并在上游引物和下游引物的5’端分別引入NdeI和XhoI限制性內(nèi)切酶位點。以便將Tb glmU基因克隆到pET16b表達(dá)載體的NdeI和XhoI位點。用具高保真的Vent DNA聚合酶,以H37Rv菌株基因組DNA為模板成功擴(kuò)增了Tb glmU基因。 2. pBS-Tb glmU的構(gòu)建及核苷酸序列測定 將純化的PCR產(chǎn)物與pBluescript II KS(-)載體進(jìn)行連接,然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α菌株的感受態(tài)細(xì)胞中。用限制性內(nèi)切酶酶切的方法鑒定陽性重組質(zhì)粒。對pBS-Tb glmU中的Tb glmU基因進(jìn)行DNA序列測定,對DNA測序結(jié)果進(jìn)行BLAST分析,結(jié)果表明所克隆的Tb glmU基因與結(jié)合分枝桿菌H37Rv菌株基因組數(shù)據(jù)庫中g(shù)lmU基因序列完全一致,表明利用PCR技術(shù)擴(kuò)增出的Tb glmU基因不存在任何堿基突變。 3.表達(dá)載體pET16b-Tb glmU的構(gòu)建 用NdeI和XhoI雙酶切pBS-Tb glmU質(zhì)粒,回收和純化glmU基因,將其連接到pET16b表達(dá)載體的NdeI和XhoI位點,構(gòu)建pET16b-Tb glmU表達(dá)質(zhì)粒。用NdeI和XhoI雙酶切的方法鑒定陽性重組質(zhì)粒。GlmU蛋白的N端與質(zhì)粒上的組氨酸標(biāo)簽形成融合蛋白。 4. Tb GlmU蛋白在大腸桿菌BL21(DE3)中表達(dá)和純化 將pET16b-Tb glmU質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中,用不同條件(IPTG的濃度、誘導(dǎo)溫度及誘導(dǎo)時間等)誘導(dǎo)攜帶pET16b-Tb glmU質(zhì)粒的BL21(DE3)表達(dá)重組蛋白。用超聲方法破碎誘導(dǎo)后的BL21(DE3),對上清和沉淀組分進(jìn)行SDS-PAGE和Western blotting分析,結(jié)果表明Tb GlmU蛋白在BL21(DE3)中可溶性表達(dá)。 采用組氨酸-Ni2+親和層析技術(shù)純化Tb GlmU蛋白,對純化的蛋白進(jìn)行蛋白質(zhì)定量(考馬斯亮藍(lán)法),第2洗脫組分(1 ml) Tb GlmU蛋白的濃度為0.533 mg/ml。SDS-PAGE和Western blotting分析結(jié)果表明我們獲得了純Tb GlmU蛋白。 5.用高效液相色譜法對Tb GlmU蛋白的酶活性測定 將反映底物葡糖胺-1-磷酸、乙酰輔酶A與純化的Tb GlmU酶蛋白在37℃反應(yīng)30分鐘,結(jié)果顯示出現(xiàn)了產(chǎn)物N-乙酰葡糖胺-1-磷酸的吸收峰,證明了純化的Tb GlmU蛋白具有葡糖胺-1-磷酸乙酰基轉(zhuǎn)移酶活性。將反應(yīng)底物焦磷酸、UDP-乙酰葡糖胺和純化出的Tb GlmU蛋白在37℃反應(yīng)30分鐘,結(jié)果顯示出現(xiàn)了產(chǎn)物N-乙酰葡糖胺-1-磷酸的吸收峰,證明Tb GlmU蛋白有N-乙酰葡萄糖胺-1-磷酸尿苷轉(zhuǎn)移酶活性。 結(jié)論: 在本研究中,我們構(gòu)建了pET16b-Tb glmU表達(dá)載體,在大腸桿菌BL21(DE3)中表達(dá)出大量的可溶性Tb GlmU蛋白。用高效液相色譜的方法對純化后的Tb GlmU蛋白進(jìn)行功能鑒定,確定了Tb GlmU蛋白有葡糖胺-1-磷酸乙�；D(zhuǎn)移酶和N-乙酰葡萄糖胺-1-磷酸尿苷轉(zhuǎn)移酶活性。這一研究結(jié)果為我們建立Tb GlmU的酶抑制劑篩選模型奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R378

【參考文獻(xiàn)】

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