【摘要】： 支原體是細(xì)胞污染物中常見的一種,污染細(xì)胞的支原體主要有5種:牛源的精氨酸支原體和萊氏支原體、豬源的豬鼻支原體、人源的口腔支原體和發(fā)酵支原體,這5種支原體占所有支原體污染的95%以上。與傳統(tǒng)的支原體檢測(cè)方法相比,PCR方法具有操作簡便易行、檢測(cè)周期短和靈敏度高等優(yōu)點(diǎn),所以近年來該方法得到了發(fā)展,但該方法目前存在的問題是無法同時(shí)擴(kuò)增出上述5種支原體、與進(jìn)化上相近的種易產(chǎn)生交叉擴(kuò)增或無法直接通過PCR結(jié)果推斷污染類型。鑒于此,本實(shí)驗(yàn)旨在建立支原體污染的巢式PCR檢測(cè)法,PCR擴(kuò)增后根據(jù)目的片段的有無判斷樣品是否被支原體污染,根據(jù)PCR產(chǎn)物的大小初步判斷所污染支原體的類型,并通過對(duì)第二輪PCR產(chǎn)物測(cè)序,進(jìn)一步證實(shí)所污染支原體類型,從而推斷污染源。 本實(shí)驗(yàn)以16S-23S rDNA的間隔序列(ISR)為靶序列,對(duì)5種支原體的ISR進(jìn)行了種內(nèi)及種間生物信息學(xué)比對(duì)分析,據(jù)分析結(jié)果自行設(shè)計(jì)兩套巢式PCR引物,以期同時(shí)有效檢測(cè)5種支原體污染。以精氨酸支原體、豬鼻支原體、口腔支原體和萊氏支原體的基因組DNA(未購買到發(fā)酵支原體)為模板,巢式PCR擴(kuò)增后分別對(duì)兩輪PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序,電泳結(jié)果和測(cè)序結(jié)果表明PCR產(chǎn)物的片段長度和堿基組成與預(yù)期結(jié)果一致。實(shí)驗(yàn)自行構(gòu)建了含口腔支原體16S-23S rDNA間隔序列的質(zhì)粒,設(shè)為陽性對(duì)照。方法學(xué)驗(yàn)證:實(shí)驗(yàn)考察了檢測(cè)限(LOD50)、特異性和耐受性三個(gè)參數(shù),并評(píng)估了交叉污染的情況。檢測(cè)限:精氨酸支原體、豬鼻支原體、口腔支原體和萊氏支原體的LOD50分別為1.5、1.0、0.6和2.7gc/reaction。特異性:以梭菌屬、乳桿菌屬和鏈球菌屬(進(jìn)化上與支原體相近)以及另外12種細(xì)菌(生產(chǎn)上常見的細(xì)菌污染類型)和Vero細(xì)胞DNA為對(duì)象,考察引物的特異性,結(jié)果表明均未產(chǎn)生交叉擴(kuò)增。耐受性:考察了不同的操作者、不同的PCR儀、樣品存儲(chǔ)條件及高濃度Vero細(xì)胞基因組DNA、細(xì)胞內(nèi)容物對(duì)PCR擴(kuò)增的影響,結(jié)果表明僅樣品存儲(chǔ)條件對(duì)檢測(cè)結(jié)果有影響。交叉污染:將強(qiáng)陽性樣本與陰性樣本同時(shí)進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增,電泳結(jié)果表明未出現(xiàn)假陽性,說明條件控制得好就可以避免假陽性的產(chǎn)生。初步應(yīng)用:同時(shí)用巢式PCR法和指示細(xì)胞法檢測(cè)了13個(gè)樣本,對(duì)兩種方法檢測(cè)結(jié)果不一致的樣品再用直接培養(yǎng)法進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果表明巢式PCR法檢測(cè)結(jié)果可信。 本實(shí)驗(yàn)建立了支原體污染的巢式PCR檢測(cè)法并對(duì)該方法進(jìn)行了初步驗(yàn)證,該方法靈敏度高,特異性好,耐受性強(qiáng),為支原體的檢測(cè)提供了技術(shù)參考。由于該方法可以4小時(shí)內(nèi)出結(jié)果,因此可對(duì)生產(chǎn)進(jìn)行過程控制,當(dāng)天獲得結(jié)果使得多個(gè)取樣點(diǎn)的在線監(jiān)測(cè)成為可能,這有利于我們及時(shí)根據(jù)結(jié)果決定下一步操作,防止污染蔓延。
【圖文】：

表 3. 引物名稱和序列Table 3. Primer name and nucleotide sequences注：引物 F2參考文獻(xiàn)[11]引物名稱 引物序列Pf1 CCTTTCTAAGGAGAAAGGCTAACTAPr1 GTCCTCCTATCTTCAAACGGGATTCPf2 AGAAAGGCTAACTAACACTTAGCACPr2 GTGCCAAGGCATCCACTGTGTF1 CGTCACACCATGGGAGCTGGTAATR1 CTTCATCGACTTTCAGACCCAF2 GTTCTTTGAAAACTGAATR2 AGACCCAAGGCATCCACCAA

注：引物 F2參考文獻(xiàn)[11]圖 1a. 萊氏支原體引物在 rDNA 操縱子上的位置Figure 1a. Primers positions of A.laidlawii at the rDNA operonR1 CTTCATCGACTTTCAGACCCAF2 GTTCTTTGAAAACTGAATR2 AGACCCAAGGCATCCACCAA
【學(xué)位授予單位】：武漢生物制品研究所
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R392

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 吳玉霞;;淋病奈瑟氏菌的細(xì)菌培養(yǎng)與PCR方法檢測(cè)的結(jié)果對(duì)比[J];右江醫(yī)學(xué);2011年03期

2 蔣毅;齊海宇;鄭曉燕;王婧;肖紅麗;陰峧宏;萬康林;;應(yīng)用PCR對(duì)呼吸道感染患者咽拭子樣本肺炎衣原體DNA的檢測(cè)[J];中國預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志;2011年08期

3 丁雪;羅曉東;羅潔琳;李小敏;沈浩賢;陳代雄;;用聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)對(duì)粉塵螨和屋塵螨進(jìn)行鑒別和檢測(cè)[J];中國人獸共患病學(xué)報(bào);2011年07期

4 劉煒煒;黃永業(yè);宋立巍;韓冰;;人IL-18基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建[J];吉林醫(yī)學(xué);2011年22期

5 胡麗慶;史煜波;孫定河;史穎嬌;黃志剛;;寧波地區(qū)腸桿菌科細(xì)菌碳青霉烯酶基因的檢測(cè)研究[J];中國微生態(tài)學(xué)雜志;2011年06期

6 李世軍;王月;陳紅;田克誠;唐光鵬;王定明;王仕香;周敬祝;劉昭兵;陳貴春;;貴州省首次從山羊分離到布魯氏菌及其種型鑒定[J];中國人獸共患病學(xué)報(bào);2011年06期

7 劉廣文;閆梅英;王志銳;董杰;郭鳳華;闞飆;;霍亂弧菌中TLC基因簇的變異性分析[J];中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志;2011年06期

8 熊貞蘭;;阪崎腸桿菌檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展[J];中國醫(yī)藥科學(xué);2011年17期

9 黃建國;吳立文;駱志輝;黃碧梅;劉菊花;劉彩珍;;手足口病腸道病毒EV71和CoxA16感染的檢測(cè)分析[J];實(shí)驗(yàn)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué);2011年03期

10 蔣力云;伍業(yè)健;李魁彪;陳藝韻;謝華萍;狄飚;吳新偉;楊智聰;;2010年廣州地區(qū)手足口病病例病原學(xué)檢測(cè)結(jié)果分析[J];寄生蟲病與感染性疾病;2011年02期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 譚詩文;余波;冉懋韜;蔡一鳴;艾玉萍;王璇;張華;;牛源HBV套式PCR方法建立及其S靶基因同源性分析[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)畜牧獸醫(yī)生物技術(shù)學(xué)分會(huì)暨中國免疫學(xué)會(huì)獸醫(yī)免疫分會(huì)第八次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2010年

2 王平;王輝;許文兵;朱元玨;;肺組織結(jié)核分枝桿菌巢式PCR快速檢測(cè)[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)年會(huì)——2011（第十二次全國呼吸病學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議）論文匯編[C];2011年

3 回文廣;趙廷昌;孫福在;張卉;王建榮;高孝強(qiáng);田麗;;實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理及其應(yīng)用[A];中國植物病理學(xué)會(huì)第六屆青年學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集——植物病理學(xué)研究進(jìn)展（第五卷）[C];2003年

4 張?zhí)?凌宗帥;徐彪;梁成珠;朱來華;孫軍;王洪兵;;實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)豬流感病毒方法的建立[A];動(dòng)物檢疫學(xué)分會(huì)2010年學(xué)術(shù)年會(huì)論文集[C];2010年

5 吳馳;張紅梅;詹能勇;鄧永聰;單萬水;余衛(wèi)業(yè);;熒光定量PCR技術(shù)在肺結(jié)核診斷中的臨床應(yīng)用研究[A];2010年中國防癆協(xié)會(huì)臨床/基礎(chǔ)專業(yè)學(xué)術(shù)大會(huì)匯編[C];2010年

6 周素娟;張鐵軍;何納;;HCV的C/E1區(qū)PCR擴(kuò)增方法的改進(jìn)[A];華東地區(qū)第十次流行病學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議暨華東地區(qū)流行病學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議20周年慶典論文集[C];2010年

7 李青;鐘青萍;王麗;;海產(chǎn)品中副溶血弧菌的PCR快速檢測(cè)方法的建立[A];“食品加工與安全”學(xué)術(shù)研討會(huì)暨2010年廣東省食品學(xué)會(huì)年會(huì)論文集[C];2010年

8 陳信忠;任聰;龔艷清;王壽昆;;實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)對(duì)蝦白斑綜合征病毒[A];經(jīng)濟(jì)發(fā)展方式轉(zhuǎn)變與自主創(chuàng)新——第十二屆中國科學(xué)技術(shù)協(xié)會(huì)年會(huì)（第三卷）[C];2010年

9 潘康成;馮興;崔恒敏;張亞蘭;趙爽;;實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)雞口服枯草芽孢桿菌后腸道芽孢桿菌數(shù)量變化[A];第四屆第十次全國學(xué)術(shù)研討會(huì)暨動(dòng)物微生態(tài)企業(yè)發(fā)展戰(zhàn)略論壇論文集（下冊(cè)）[C];2010年

10 孫秋影;盧長春;魏強(qiáng);龐淑芬;;LightCycler 480實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀在獻(xiàn)血者血液篩查中的應(yīng)用[A];中國輸血協(xié)會(huì)第五屆輸血大會(huì)論文專集（摘要篇）[C];2010年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前10條

1 通文;Bio—Rad公司推出快速定量PCR反應(yīng)液[N];中國醫(yī)藥報(bào);2008年

2 通言;ABI實(shí)時(shí)定量PCR儀獲準(zhǔn)與rRT—PCR Flu Panel聯(lián)用[N];中國醫(yī)藥報(bào);2008年

3 郭偉立;實(shí)時(shí)、個(gè)體、高效[N];中國醫(yī)藥報(bào);2011年

4 記者 瞿劍;豬是否“感冒”五小時(shí)見分曉[N];科技日?qǐng)?bào);2009年

5 《金周刊》記者 朱杰;羅氏為何青睞深圳匹基[N];中國經(jīng)營報(bào);2001年

6 《金周刊》記者 朱杰 新華社記者 王璐;記者調(diào)查廣州達(dá)安造假內(nèi)幕[N];中國經(jīng)營報(bào);2001年

7 記者 張平陽 楊斌鵠;快速檢測(cè)甲流 西安批量生產(chǎn)關(guān)鍵設(shè)備[N];西安日?qǐng)?bào);2009年

8 季愛華;飼料中牛羊源性成分測(cè)定新法通過審定[N];中國食品報(bào);2009年

9 ;飼料中牛羊源性成分測(cè)定法標(biāo)準(zhǔn)通過審查[N];中國畜牧獸醫(yī)報(bào);2009年

10 本報(bào)記者 李穎;多元產(chǎn)品的創(chuàng)新之道[N];科技日?qǐng)?bào);2011年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 張?jiān)谄?熒光定量PCR檢測(cè)禽白血病病毒與RNA干擾抑制J亞群禽白血病病毒復(fù)制的研究[D];內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué);2010年

2 渠柏艷;基于血液樣品和微流控芯片技術(shù)的細(xì)胞分離、PCR擴(kuò)增及DNA測(cè)序方法研究[D];東北大學(xué);2009年

3 張麗;實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)兒童急性早幼粒細(xì)胞白血病PML/RARα融合基因[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2011年

4 李澤松;缺失型α-地中海貧血基因診斷芯片及在分子流行病學(xué)研究中的應(yīng)用[D];重慶大學(xué);2008年

5 陳智勇;胰腺癌相關(guān)基因mucin4的初步研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2005年

6 王彥君;細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4基因微衛(wèi)星多態(tài)性與炎癥性腸病相關(guān)性研究[D];吉林大學(xué);2008年

7 馬孟根;豬源致病性沙門氏菌耐藥基因PCR和基因芯片檢測(cè)技術(shù)研究[D];四川大學(xué);2005年

8 肖性龍;多重?zé)晒釶CR與液相芯片高通量病原體檢測(cè)體系的建立與應(yīng)用[D];華南理工大學(xué);2010年

9 夏乾峰;二聚體突變引物定量PCR技術(shù)的研發(fā)及其臨床應(yīng)用[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2011年

10 劉國棟;基于胃黏膜多重Real time PCR的幽門螺桿菌根除藥物選擇技術(shù)的建立與評(píng)價(jià)[D];中國疾病預(yù)防控制中心;2011年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 李菁竹;支原體污染的巢式PCR檢測(cè)法的摸索及其初步驗(yàn)證[D];武漢生物制品研究所;2010年

2 王穩(wěn);利用RT-PCR驗(yàn)證基于小鼠外顯子芯片發(fā)現(xiàn)的腦缺血相關(guān)基因表達(dá)的研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2010年

3 劉新軍;表達(dá)布氏桿菌sodc基因的重組沙門氏菌的構(gòu)建及不同種布氏桿菌鑒別PCR檢測(cè)方法的建立[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2010年

4 郭世奎;實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)結(jié)直腸癌患者腸道微生態(tài)的研究[D];昆明醫(yī)學(xué)院;2011年

5 金戈;博爾納病病毒磷蛋白的原核表達(dá)和p24片段熒光定量PCR試劑盒的研制開發(fā)[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2011年

6 劉志國;實(shí)時(shí)多重?zé)晒釶CR快速鑒別布魯菌方法的建立[D];內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué);2010年

7 鄭升博;豬鏈球菌多重PCR檢測(cè)方法的建立及屠宰場(chǎng)樣品感染率的調(diào)查研究[D];上海交通大學(xué);2010年

8 劉寧;PCR擴(kuò)增16srRNA基因以快速診斷敗血癥及分型細(xì)菌[D];南昌大學(xué);2010年

9 陳晶晶;不同納米材料對(duì)PCR優(yōu)化作用的研究及機(jī)制探討[D];東華大學(xué);2011年

10 譚景尹;PCR—膜芯片~(?)技術(shù)檢測(cè)結(jié)核桿菌耐藥基因突變的應(yīng)用研究[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2011年

，

本文編號(hào)：2532302