【摘要】： 支原體是細胞污染物中常見的一種,污染細胞的支原體主要有5種:牛源的精氨酸支原體和萊氏支原體、豬源的豬鼻支原體、人源的口腔支原體和發(fā)酵支原體,這5種支原體占所有支原體污染的95%以上。與傳統(tǒng)的支原體檢測方法相比,PCR方法具有操作簡便易行、檢測周期短和靈敏度高等優(yōu)點,所以近年來該方法得到了發(fā)展,但該方法目前存在的問題是無法同時擴增出上述5種支原體、與進化上相近的種易產(chǎn)生交叉擴增或無法直接通過PCR結(jié)果推斷污染類型。鑒于此,本實驗旨在建立支原體污染的巢式PCR檢測法,PCR擴增后根據(jù)目的片段的有無判斷樣品是否被支原體污染,根據(jù)PCR產(chǎn)物的大小初步判斷所污染支原體的類型,并通過對第二輪PCR產(chǎn)物測序,進一步證實所污染支原體類型,從而推斷污染源。 本實驗以16S-23S rDNA的間隔序列(ISR)為靶序列,對5種支原體的ISR進行了種內(nèi)及種間生物信息學比對分析,據(jù)分析結(jié)果自行設(shè)計兩套巢式PCR引物,以期同時有效檢測5種支原體污染。以精氨酸支原體、豬鼻支原體、口腔支原體和萊氏支原體的基因組DNA(未購買到發(fā)酵支原體)為模板,巢式PCR擴增后分別對兩輪PCR產(chǎn)物進行測序,電泳結(jié)果和測序結(jié)果表明PCR產(chǎn)物的片段長度和堿基組成與預期結(jié)果一致。實驗自行構(gòu)建了含口腔支原體16S-23S rDNA間隔序列的質(zhì)粒,設(shè)為陽性對照。方法學驗證:實驗考察了檢測限(LOD50)、特異性和耐受性三個參數(shù),并評估了交叉污染的情況。檢測限:精氨酸支原體、豬鼻支原體、口腔支原體和萊氏支原體的LOD50分別為1.5、1.0、0.6和2.7gc/reaction。特異性:以梭菌屬、乳桿菌屬和鏈球菌屬(進化上與支原體相近)以及另外12種細菌(生產(chǎn)上常見的細菌污染類型)和Vero細胞DNA為對象,考察引物的特異性,結(jié)果表明均未產(chǎn)生交叉擴增。耐受性:考察了不同的操作者、不同的PCR儀、樣品存儲條件及高濃度Vero細胞基因組DNA、細胞內(nèi)容物對PCR擴增的影響,結(jié)果表明僅樣品存儲條件對檢測結(jié)果有影響。交叉污染:將強陽性樣本與陰性樣本同時進行巢式PCR擴增,電泳結(jié)果表明未出現(xiàn)假陽性,說明條件控制得好就可以避免假陽性的產(chǎn)生。初步應用:同時用巢式PCR法和指示細胞法檢測了13個樣本,對兩種方法檢測結(jié)果不一致的樣品再用直接培養(yǎng)法進行檢測,結(jié)果表明巢式PCR法檢測結(jié)果可信。 本實驗建立了支原體污染的巢式PCR檢測法并對該方法進行了初步驗證,該方法靈敏度高,特異性好,耐受性強,為支原體的檢測提供了技術(shù)參考。由于該方法可以4小時內(nèi)出結(jié)果,因此可對生產(chǎn)進行過程控制,當天獲得結(jié)果使得多個取樣點的在線監(jiān)測成為可能,這有利于我們及時根據(jù)結(jié)果決定下一步操作,防止污染蔓延。
【圖文】：

表 3. 引物名稱和序列Table 3. Primer name and nucleotide sequences注：引物 F2參考文獻[11]引物名稱 引物序列Pf1 CCTTTCTAAGGAGAAAGGCTAACTAPr1 GTCCTCCTATCTTCAAACGGGATTCPf2 AGAAAGGCTAACTAACACTTAGCACPr2 GTGCCAAGGCATCCACTGTGTF1 CGTCACACCATGGGAGCTGGTAATR1 CTTCATCGACTTTCAGACCCAF2 GTTCTTTGAAAACTGAATR2 AGACCCAAGGCATCCACCAA

注：引物 F2參考文獻[11]圖 1a. 萊氏支原體引物在 rDNA 操縱子上的位置Figure 1a. Primers positions of A.laidlawii at the rDNA operonR1 CTTCATCGACTTTCAGACCCAF2 GTTCTTTGAAAACTGAATR2 AGACCCAAGGCATCCACCAA
【學位授予單位】：武漢生物制品研究所
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R392

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本文編號：2532302