【摘要】： 據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì),2007年全年新發(fā)人類免疫缺陷病毒1型(HumanImmunodeficiency Virus Type 1,HIV-1)感染人數(shù)為270萬(wàn),200萬(wàn)例死亡與HIV-1相關(guān),全球估計(jì)仍有3千多萬(wàn)HIV-1感染者。有效的HIV-1疫苗是控制傳染病蔓延的最佳手段。然而,盡管HIV-1疫苗研發(fā)超過(guò)20年,研制有效的疫苗控制HIV-1感染仍然面臨許多挑戰(zhàn)。 挑戰(zhàn)之一就是缺乏合適的動(dòng)物模型用于臨床前篩選候選疫苗。由于HIV-1只能感染豬尾猴和黑猩猩等動(dòng)物,這類動(dòng)物數(shù)量較少,而且感染后難以出現(xiàn)艾滋病,已不適宜HIV-1相關(guān)的實(shí)驗(yàn)應(yīng)用。當(dāng)前大多數(shù)HIV-1臨床前疫苗有效性評(píng)價(jià)是在嵌合猿猴/人免疫缺陷病毒(Chimeric Simian/Human Immunodeficency Virus,SHIV)/恒河猴模型上進(jìn)行的,而這類模型成本高,必須在大動(dòng)物P3實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行,因而無(wú)法在普通研究機(jī)構(gòu)進(jìn)行,難以滿足檢測(cè)當(dāng)前廣泛的疫苗以及疫苗策略篩選的需要。而小動(dòng)物由于宿主自身限制無(wú)法被HIV-1感染,難以直接建立疫苗保護(hù)性評(píng)價(jià)模型。而多年來(lái)利用重建人類免疫系統(tǒng)等方式改造小鼠等宿主,已經(jīng)較為成功地在小動(dòng)物上建立了HIV-1感染模型。在此基礎(chǔ)上,還成功地運(yùn)用于評(píng)價(jià)中和抗體以及抗病毒藥物的療效,但因?yàn)榉椒ㄗ陨淼南拗?在此類模型上尚不能活化產(chǎn)生長(zhǎng)期的獲得性免疫,所以無(wú)法用于疫苗保護(hù)性評(píng)價(jià)。 在本研究的第一部分中,為了構(gòu)建可用于疫苗保護(hù)性評(píng)價(jià)的小鼠模型,我們以復(fù)制型痘苗病毒天壇株為載體,構(gòu)建了表達(dá)螢火蟲(chóng)熒光素酶與HIV-1 Gag融合蛋白的重組痘苗病毒rTTV-lucgag。我們利用熒光素酶活性替代病毒滴定,首先通過(guò)在腹腔接種該重組痘苗病毒后分析其在小鼠體內(nèi)的動(dòng)態(tài)分布。結(jié)果表明,該重組痘苗病毒在小鼠卵巢、子宮、宮頸等部位有較高的復(fù)制能力,在攻毒后第2天達(dá)到峰值(卵巢,242 273±131 222Relative Luciferase Unit(RLU)/毫克蛋白;子宮,192 613±328 398 RLU/毫克蛋白;宮頸,78 182±135 049 RLU/毫克蛋白),攻毒后第5天在卵巢部位還能檢測(cè)到病毒分布(66 621±83 630 RLU/毫克蛋白),病毒在其他組織復(fù)制能力相對(duì)較弱。以上結(jié)果說(shuō)明卵巢是最佳的評(píng)價(jià)位點(diǎn),可用于評(píng)價(jià)Gag疫苗保護(hù)效果,而且卵巢部位熒光素酶活性分別與病毒滴度(r~2=0.7143,p＜0.0001)和Gag表達(dá)(r~2=0.5699,p=0.03)顯著相關(guān)。隨后,我們以表達(dá)HIV-1 Gag免疫原的質(zhì)粒DNA為疫苗免疫小鼠,通過(guò)對(duì)比疫苗免疫小鼠與對(duì)照小鼠在攻毒后卵巢組織病毒復(fù)制能力的差異,驗(yàn)證我們的攻毒模型可靠性。攻毒后第3天,HIV-1 Gag DNA疫苗免疫組的小鼠卵巢熒光素酶活性為1 538±462.5 RLU/毫克蛋白,約為對(duì)照組(6 006±3 141 RLU/毫克蛋白)的四分之一,該結(jié)果表明疫苗免疫后小鼠清除病毒能力強(qiáng)于對(duì)照組小鼠。這些數(shù)據(jù)表明該重組病毒顯示出較好的潛力,能用于評(píng)價(jià)HIV-1 Gag DNA疫苗的保護(hù)效果。因此,我們認(rèn)為熒光素酶活性在體內(nèi)能代表痘苗病毒復(fù)制,可以代替病毒滴定用于監(jiān)測(cè)病毒體內(nèi)復(fù)制,而且這種rTTV-lucgag/小鼠模型能用于HIV-1 Gag疫苗由殺傷性T細(xì)胞介導(dǎo)的保護(hù)效果評(píng)價(jià)。 HIV-1疫苗研發(fā)的另一個(gè)挑戰(zhàn)是開(kāi)發(fā)安全有效的疫苗載體。病毒載體具有感染性和復(fù)制能力,是當(dāng)前用于基因投遞最有效的載體,但安全性、載體反應(yīng)、插入片段大小限制以及病毒嗜性等因素限制了其在體內(nèi)基因治療和疫苗研究中的應(yīng)用。DNA疫苗本身不具有免疫原性,可以進(jìn)行多次重復(fù)免疫,但其體內(nèi)轉(zhuǎn)染效率低下,限制了其誘發(fā)免疫應(yīng)答的能力。因而,基因治療和疫苗開(kāi)發(fā)還需要安全有效的DNA疫苗投遞載體。陽(yáng)離子聚合物聚二甲氨基甲基丙烯酸乙酯(Poly[2-(N,N-dimethylamino)Ethyl Methacrylate],PDMAEMA),和聚乙烯亞胺(Polyethylenimine,PEI)一樣,能通過(guò)靜電作用與負(fù)電性的DNA結(jié)合,從而提高其體外轉(zhuǎn)染效率,但高細(xì)胞毒性限制了其在體內(nèi)的應(yīng)用。在本研究第二部分,我們通過(guò)聚乙二醇(Polyethyleneglycol,PEG)化改造了高細(xì)胞毒性的陽(yáng)離子聚合物PDMAEMA。凝膠延遲實(shí)驗(yàn)、粒徑測(cè)試以及電鏡結(jié)果均表明,PEG化改造后的PDMAEMA仍保留包裹DNA的能力,能與DNA形成直徑為150nm左右的復(fù)合物顆粒。隨后我們將復(fù)合物與293T細(xì)胞共孵育,以檢測(cè)其細(xì)胞毒性以及轉(zhuǎn)染效率。數(shù)據(jù)表明,在N/P為30及以上時(shí),PEG改造后顯著降低了PDMAEMA的細(xì)胞毒性,在一定范圍內(nèi),細(xì)胞毒性下降幅度隨N/P增加而增大,同時(shí)我們以綠色熒光蛋白為報(bào)告基因,研究了PEG改造對(duì)細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率的影響,發(fā)現(xiàn)PEG化后的PDMAEMA體外轉(zhuǎn)染效率也有較大程度降低,其轉(zhuǎn)染效率不到PEI的二十分之一。我們以表達(dá)HIV-1 Gag免疫原的質(zhì)粒DNA黏膜初免,痘苗病毒載體系統(tǒng)加強(qiáng)為模型,評(píng)價(jià)了PEG化的PDMAEMA對(duì)DNA疫苗鼻內(nèi)黏膜初免效果,結(jié)果表明,PEG化的PDMAEMA能引起活躍的Gag特異性T細(xì)胞免疫應(yīng)答(163±35 Specific Spot Forming Cells(SFCs)/1×10~6脾細(xì)胞),顯著高于單獨(dú)DNA疫苗效果(56±5 SFCs/1×10~6脾細(xì)胞,p=0.0052),而且顯著高于PEI組(99±14 SFCs/1×10~6脾細(xì)胞,p=0.0441)。PEG化的PDMAEMA引起血清抗體水平也顯著高于單獨(dú)DNA疫苗組(p=0.0341)。我們隨后還在體外證明了PEG化的PDMAEMA具有免疫佐劑活性,能有效刺激小鼠巨噬細(xì)胞腫瘤壞死因子α(Tumor Necrosis Factor alpha,TNF-α)、白細(xì)胞介素10(Interleukin 10,IL-10)等炎癥因子應(yīng)答,從而表明其可具備能增進(jìn)疫苗效果的佐劑作用�？傊�,PEG改造后的PDMAEMA能顯著降低細(xì)胞毒性,還能有效提高DNA疫苗的黏膜初免效果。以上結(jié)果表明,對(duì)于陽(yáng)離子聚合物載體,由于存在潛在的佐劑效應(yīng),體外轉(zhuǎn)染效率并不能決定其體內(nèi)疫苗免疫效果。
【圖文】：

PnMAEM幾

為了考察PEG化對(duì)于細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率的影響，，我們用表達(dá)綠色熒光蛋白的質(zhì)粒PSv一EGFP分別與PEG一PDMAEMA和PDMAEMA復(fù)合，孵育充分后對(duì)293T細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，48小時(shí)后處理細(xì)胞進(jìn)行流式檢測(cè)(圖2一sc)，結(jié)果如圖2一5b所示。對(duì)比兩組數(shù)據(jù)我們可以看出，PEG化對(duì)于體外轉(zhuǎn)染效率的影響明顯。均聚物PDMAEMA的最高轉(zhuǎn)染效率約為10%，而PEG化后最高轉(zhuǎn)染效率僅為1%。這可能是由于PEG化后復(fù)合粒子的表面電勢(shì)大大降低，導(dǎo)致其與表面帶負(fù)電荷的細(xì)胞結(jié)合能力下降，同時(shí)和PDMAEMA段結(jié)合的DNA從復(fù)合體上解離也更加困難【65，66]。另外，兩種聚合物形成的復(fù)合物的轉(zhuǎn)染效率均與N用比值相關(guān)。PEG一PDMAEM刀DNA復(fù)合物的最高轉(zhuǎn)染效率出現(xiàn)在N/P=45。 2.3.4PEG一PDMAEMA促進(jìn)DNA疫苗薪膜初免效果為測(cè)試PEG一PDMAEMA用作DNA疫苗載體赫膜初免效果，同時(shí)考慮到不同N/P比對(duì)體外轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞毒性的影響
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)疾病預(yù)防控制中心
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R392

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本文編號(hào)：2530011