【摘要】： 研究背景 毒品濫用是當(dāng)今各國(guó)都面臨的社會(huì)問題。由于依賴性精神藥物的直接藥理學(xué)作用靶器官是中樞神經(jīng)系統(tǒng),因此其對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的研究一直倍受關(guān)注。METH有很強(qiáng)的精神刺激性和依賴性,且其被濫用的趨勢(shì)近來逐年上升。目前的研究表明,METH的神經(jīng)毒性作用與某些活性物質(zhì)的產(chǎn)生密切相關(guān),如活性氧、一氧化氮及其次級(jí)產(chǎn)物ONOO-等。由這些活性物質(zhì)所誘發(fā)的一系列神經(jīng)毒性事件,是導(dǎo)致?lián)p傷敏感腦區(qū)(單胺類神經(jīng)末梢)發(fā)生不可逆性實(shí)質(zhì)損傷的主要因素,而MG誘發(fā)的炎性反應(yīng)在其中發(fā)揮了十分重要的作用。 炎癥是機(jī)體一種防御性的反應(yīng),但如不能有效地加以控制,則導(dǎo)致組織損傷。有研究表明,MG參與了中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)多種病理(如神經(jīng)毒性劑的毒性損傷、帕金森病等神經(jīng)慢性疾病、局部缺血甚至腦外傷)條件下的慢性炎癥反應(yīng),并加重了組織細(xì)胞的損傷。同樣METH作用后,受損的敏感腦區(qū)內(nèi)出現(xiàn)了MG的激活,表明MG參與了損傷的過程。MG作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)固有的唯一免疫細(xì)胞類型,與上述神經(jīng)炎性損傷過程密不可分。但由于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的復(fù)雜性,毒性劑量METH所引發(fā)的MG激活及其誘發(fā)的炎性損傷反應(yīng)的研究還存在很多疑問:如METH與MG的激活之間有什么直接關(guān)系?在MG激活的時(shí)程中,受損敏感腦區(qū)發(fā)生的哪些變化與其激活有關(guān)?受損腦區(qū)內(nèi)是否存在某些因素對(duì)MG激活及其后續(xù)炎性反應(yīng)具有調(diào)節(jié)作用?對(duì)于上述問題,至今未有十分明確的結(jié)論,更缺乏系統(tǒng)性的研究。 本研究?jī)?nèi)容系在本室近幾年來研究METH中樞毒性損傷機(jī)制的基礎(chǔ)上,通過體內(nèi)和體外不同實(shí)驗(yàn)體系,對(duì)MG的激活及其所繼發(fā)的炎癥病理損傷過程作為研究主線,為闡明這一炎癥反應(yīng)損傷發(fā)生的確切機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)證據(jù)。 研究目的 中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi),由于METH的神經(jīng)毒性對(duì)單胺能神經(jīng)末梢具有選擇性,因此我們選擇紋狀體為研究對(duì)象。研究紋狀體內(nèi)MG激活的時(shí)程變化、形態(tài)學(xué)變化、表型變化,及其激活時(shí)程內(nèi)的病理損傷事件;模擬METH毒性作用初期微環(huán)境的變化(氧化應(yīng)激),在體外條件下研究MG內(nèi)相關(guān)的炎癥反應(yīng)細(xì)胞信號(hào)調(diào)節(jié)通路蛋白表達(dá)的變化等。通過上述研究,來初步明確MG激活及誘發(fā)的炎癥反應(yīng)在METH神經(jīng)毒性損傷中的作用。 研究方法 1.MG參與METH大鼠腦紋狀體炎性損傷的研究 1.1實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷膹?fù)制及紋狀體內(nèi)MG激活特性的研究 動(dòng)物模型為成年雄性Wistar大鼠(體重200±20g,n=48),平均分為實(shí)驗(yàn)組(腹腔注射METH,15mg/Kg,共8次,每次間隔12h)和對(duì)照組(給藥方式相同,每次注射1ml生理鹽水),分別于首次注射后第0.5d、1d、2d、3d、4d、5d、6d和7d進(jìn)行取材及各項(xiàng)檢測(cè)。研究?jī)?nèi)容主要包括CD-11b抗體免疫組化法檢測(cè)MG激活比率及時(shí)程變化,透射電鏡觀察其激活后的超微結(jié)構(gòu)改變和流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD-11b和MHC-Ⅱ雙陽性細(xì)胞率的變化,進(jìn)一步明確MG的激活。 1.2紋狀體內(nèi)導(dǎo)致MG激活的誘因及調(diào)控因素 在前期明確MG的激活水平及時(shí)程變化的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步研究導(dǎo)致其激活的主要因素及相關(guān)的調(diào)控因素。內(nèi)容主要包括:高效液相色譜法檢測(cè)紋狀體內(nèi)多巴胺含量、ROS試劑盒檢測(cè)紋狀體內(nèi)活性氧含量和Western blotting法檢測(cè)CD-200蛋白表達(dá)量的變化。 1.3紋狀體內(nèi)MG參與的炎性反應(yīng)損傷及途徑 本部分主要對(duì)MG炎性損傷反應(yīng)方式,以及紋狀體的損傷程度進(jìn)行研究。具體包括:ELISA法檢測(cè)促炎細(xì)胞因子TNF-α和IL-1β含量的變化、免疫組化和Western blotting法檢測(cè)TH表達(dá)量的變化以及透射電鏡觀察紋狀體內(nèi)神經(jīng)纖維及末梢的超微結(jié)構(gòu)改變。 2.體外氧化應(yīng)激條件下MG的激活及CD200分子對(duì)其激活和炎性反應(yīng)的調(diào)控作用 2.1新生Wistar大鼠原代MG培養(yǎng)體系的建立和皮質(zhì)神經(jīng)元的分離 通過同系新生大鼠腦皮質(zhì)原代MG的分離純化培養(yǎng)和皮質(zhì)神經(jīng)元的分離,以及氧化應(yīng)激條件MG激活模型的建立,來研究氧化應(yīng)激條件下CD200參與調(diào)控MG激活及調(diào)控方式的初步研究。主要研究?jī)?nèi)容包括:采用利多卡因(12mmol/L)處理及差速貼壁的方法獲得純化的原代MG,并通過測(cè)定生長(zhǎng)曲線來評(píng)價(jià)原代MG培養(yǎng)體系的穩(wěn)定性;采用形態(tài)學(xué)觀察及免疫熒光標(biāo)記CD-11b和MHC-Ⅱ抗體的方法對(duì)分離得到的MG進(jìn)行純度和活化狀態(tài)的鑒定;采用梯度微孔過濾和高糖培養(yǎng)基保護(hù)的方法,進(jìn)行皮質(zhì)神經(jīng)元分離,并進(jìn)行CD200分子表達(dá)率鑒定,為研究CD200分子對(duì)MG激活及激活后炎性反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用建立實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 2.2體外氧化應(yīng)激條件下MG激活模型的建立及CD200參與的調(diào)控作用 以LPS(0.5mg/L)為陽性對(duì)照,分別采用H_2O_2(100μmol/L)和METH(200μmol/L)為處理因素,并檢測(cè)MG的激活特性。以此作為基礎(chǔ),來研究分離得到的神經(jīng)元(CD200)對(duì)氧化應(yīng)激條件下MG的激活及炎性反信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用。主要研究?jī)?nèi)容包括:氧化應(yīng)激條件下,通過Western blotting法及免疫熒光標(biāo)記法檢測(cè)p-p38 MAPK的表達(dá)量及胞內(nèi)表達(dá)定位、Western bloting法檢測(cè)IκB-α蛋白表達(dá)量、ELISA法檢測(cè)各組培養(yǎng)液中TNF-α和IL-1β的含量的變化,來明確急性分離的神經(jīng)元參與調(diào)控MG激活及其調(diào)控方式。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 1.MG參與METH中毒動(dòng)物模型大鼠腦紋狀體炎性損傷的研究 1.1動(dòng)物模型的復(fù)制及紋狀體內(nèi)MG激活特性的研究 毒性劑量METH作用下,實(shí)驗(yàn)大鼠出現(xiàn)了典型的刺激癥狀,表明成功復(fù)制出METH中毒動(dòng)物模型�！皩�(shí)驗(yàn)組”紋狀體內(nèi)MG形態(tài)學(xué)變化:胞體變大,細(xì)胞突起變短,形態(tài)豐滿,呈“灌木叢樣”;另有部分MG,胞體變大、突起消失,呈“阿米巴樣”;透射電鏡下見激活的MG胞體明顯變大,胞核電子密度降低,胞突變短增粗,胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器豐富,并可見較多的溶酶體,另見其與神經(jīng)元或軸突之間具有親密的比鄰關(guān)系。MG的激活率及時(shí)程:與對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組自首次注射后第1d-5d具有上升趨勢(shì),且第1d-7d均顯著升高(n=9,P＜0.001)。激活MG的表型變化:CD-11b和MHC-Ⅱ雙陽性細(xì)胞率逐漸升高。 1.2紋狀體內(nèi)誘發(fā)MG的激活及調(diào)控機(jī)制 METH作用后,與“對(duì)照組”相比:“實(shí)驗(yàn)組”多巴胺含量降低,且兩組之間有顯著性差異(n=3,P＜0.05);“實(shí)驗(yàn)組”活性氧含量出現(xiàn)顯著性升高(n=3,P＜0.05);“實(shí)驗(yàn)組”CD200蛋白表達(dá)量有降低的趨勢(shì)。 1.3紋狀體內(nèi)MG參與的炎性反應(yīng)損傷及損傷途徑 METH作用后,紋狀體內(nèi)TNF-α和IL-1β的含量出現(xiàn)顯著性升高(n=3,P＜0.05),“實(shí)驗(yàn)組”TH陽性免疫組化反應(yīng)強(qiáng)度和蛋白表達(dá)量均出現(xiàn)降低,以及紋狀體內(nèi)神經(jīng)纖維和末梢出現(xiàn)水腫、微絲溶解以及線粒體空泡化。 2.體外氧化應(yīng)激條件下MG的激活及CD200分子對(duì)其激活和炎性反應(yīng)的調(diào)控作用 2.1新生Wistar大鼠原代MG培養(yǎng)體系的建立和皮質(zhì)神經(jīng)元的分離 分離得到了原代MG,其存活率≥95%,透射電鏡下見純化后的MG結(jié)構(gòu)完好,CD-11b抗體檢測(cè)陽性細(xì)胞率為97.0%,MHC-Ⅱ抗體陽性細(xì)胞率為2.47%;分離后皮質(zhì)得到的神經(jīng)元經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)表達(dá)CD200的陽性細(xì)胞率約為87%。 2.2氧化應(yīng)激條件下體外MG激活模型的建立及CD200參與調(diào)控作用 應(yīng)用生理鹽水、LPS、METH和H_2O_2分別處理原代培養(yǎng)的MG,結(jié)果LPS和H_2O_2均導(dǎo)致MHC-Ⅱ分子表達(dá)的陽性率升高、培養(yǎng)液內(nèi)TNF-α和IL-1β的含量升高,而生理鹽水和METH則無此作用。比較H_2O_2和H_2O_2+CD200對(duì)培養(yǎng)的MG激活及后續(xù)炎性反應(yīng)的作用,結(jié)果顯示H_2O_2+CD200處理后MG表達(dá)MHC-Ⅱ的陽性率低于單純H_2O_2的處理。 應(yīng)用生理鹽水、LPS、METH和H_2O_2分別處理原代培養(yǎng)的MG,結(jié)果LPS和H_2O_2均導(dǎo)致表達(dá)MHC-Ⅱ分子的陽性率升高、培養(yǎng)液內(nèi)TNF-α和IL-1β的含量升高,而生理鹽水和METH則無此作用。與單純采用H_2O_2對(duì)MG的激活及炎性反應(yīng)作用相比,H_2O_2+CD200處理后MG表達(dá)MHC-Ⅱ的陽性率、p-p38 MAPK的蛋白表達(dá)量和TNF-α及IL-1β的含量均降低,而IκB-α蛋白表達(dá)量升高。 研究結(jié)論 1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物經(jīng)METH刺激后,紋狀體內(nèi)MG被迅速激活;激活的MG功能開始活躍,并發(fā)揮炎性反應(yīng);同時(shí)MG具有了介導(dǎo)相應(yīng)類型的淋巴細(xì)胞參與免疫反應(yīng)的能力,并通過該途徑強(qiáng)化了炎癥反應(yīng)的發(fā)生。 2.METH的刺激作用,導(dǎo)致了紋狀體內(nèi)的DA大量釋放并降解,同時(shí)產(chǎn)生ROS,并誘發(fā)了MG激活:而MG激活后,又進(jìn)一步導(dǎo)致了紋狀體內(nèi)ROS含量的持續(xù)升高,表明MG通過釋放ROS的方式參與了毒性損傷過程;紋狀體內(nèi)CD200表達(dá)量的降低參與了調(diào)控MG的激活。 3.毒性劑量METH的連續(xù)刺激導(dǎo)致了紋狀體內(nèi)TNF-α和IL-1β含量升高,表明MG激活后通過釋放細(xì)胞因子的這一途徑參與了紋狀體內(nèi)神經(jīng)組織的損傷。TH蛋白表達(dá)量出現(xiàn)了明顯降低以及神經(jīng)纖維及末梢的形態(tài)學(xué)異常,說明上述因素導(dǎo)致紋狀體發(fā)生實(shí)質(zhì)性損傷;盡管TH作為DA合成的第一限速酶,METH作用初期DA含量的降低并非是因?yàn)門H蛋白表達(dá)量降低所致。MG誘發(fā)的炎性反應(yīng)與METH刺激后紋狀體損傷密切相關(guān)。 4.成功地建立同系新生大鼠原代MG的培養(yǎng)體系,為開展下一步體外實(shí)驗(yàn)研究奠定基礎(chǔ);急性分離獲得的皮質(zhì)神經(jīng)元可用來進(jìn)一步研究其對(duì)MG激活的調(diào)控作用。 5.體外條件下,氧化應(yīng)激條件導(dǎo)致了MG的激活,而METH對(duì)MG并不具有激活作用;激活MG表達(dá)MHC-Ⅱ的陽性細(xì)胞率升高以及培養(yǎng)介質(zhì)內(nèi)TNF-α和IL-1β的含量增加,這些結(jié)果進(jìn)一步肯定了體內(nèi)ROS含量的升高導(dǎo)致MG激活的結(jié)論;CD200分子可通過抑制p38 MAPK的磷酸化,進(jìn)而下調(diào)NF-κB的活化,起到抑制MG激活及炎性反應(yīng)的作用;結(jié)合體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,METH導(dǎo)致紋狀體內(nèi)CD200表達(dá)量的下調(diào),則進(jìn)一步強(qiáng)化了MG介導(dǎo)的炎性反應(yīng)損傷。
【圖文】：

’“l(fā)，在一側(cè)腦半球距中線lmm至3mm處做矢(厚度為Zmm)，將腦片平放于載玻片上，按圖譜上的位置辨認(rèn)紋狀體腦區(qū)，手術(shù)刀分離切取(圖1一1一1)。我們?cè)谇捌陬A(yù)實(shí)驗(yàn)中將上述的腦片進(jìn)行石蠟包理切片后于鏡下觀察，組織定位準(zhǔn)確。

首次注射METH后時(shí)間(天)注:*:介之0.05，**:產(chǎn)長(zhǎng)0.001(同時(shí)間點(diǎn)“實(shí)驗(yàn)組”VS“對(duì)照組”圖1一2一 3METH注射后紋狀體內(nèi)DA含量的變化Fig.1一2一 3TheDAeonientinstriatumPost一METH…2.紋狀體內(nèi)ROS含量的變化根據(jù)測(cè)得每份樣品的吸光度值的變化進(jìn)行換算，得出ROS相對(duì)量的變化。經(jīng)析因設(shè)計(jì)方差分析統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示(表1一2一3)，“實(shí)驗(yàn)分組”和“檢測(cè)時(shí)間”之間具有交互效應(yīng)(P<0.001)，可以進(jìn)一步比較各檢測(cè)時(shí)間上“對(duì)照組”和“實(shí)驗(yàn)組”ROS含量的差異。進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示(表1一2一4，圖1一2一4)與“對(duì)照組”相比，“實(shí)驗(yàn)組”首次注射METH后第o.sd的ROS含量雖未顯示出統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但其含量開始升高;從第ld開始以后的各時(shí)間點(diǎn)ROS含量均升高，，且有顯著性差異(n二3
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號(hào)】：R363

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2526929