【摘要】： 【目的】 1.建立腸缺血再灌注損傷的動(dòng)物模型,了解大鼠小腸腸黏膜屏障功能受損后的病理改變。 2.分離、培養(yǎng)、純化大鼠骨髓源性間充質(zhì)干細(xì)胞,獲得足夠的間充質(zhì)干細(xì)胞,并對其表面分子進(jìn)行檢測。 3.通過骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療腸屏障功能障礙的大鼠,評價(jià)其對大鼠腸屏障功能的保護(hù)作用。 【方法】 1.采用阻斷腸系膜前動(dòng)脈的方法建立腸缺血再灌注損傷的模型:健康雄性SD大鼠,250g-350g,氯胺酮麻醉并固定大鼠,于腹前正中線開腹,分層剪開皮毛、腹肌。找到腸系膜前動(dòng)脈,以3cm血管夾夾閉45min后開放,恢復(fù)血供。在造模后24h處死大鼠,獲取小腸病理組織,依據(jù)Chiu’小腸組織損傷評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)對小腸損傷情況進(jìn)行評分。對照組大鼠僅作假手術(shù)。 2.采用全骨髓差異貼壁法培養(yǎng)獲得骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs):無菌條件下取大鼠雙側(cè)下肢股骨和脛骨,剪開骨端,DMEM反復(fù)沖洗骨髓腔至骨干發(fā)白,將沖洗下的細(xì)胞懸液1000rpm離心5min,棄去上清液,用含10%~15%胎牛血清培養(yǎng)液重懸后,接種于75cm2培養(yǎng)瓶,在37℃,5% CO2,飽和濕度CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),每天觀察細(xì)胞生長、貼壁情況。細(xì)胞生長至培養(yǎng)瓶面積約90%時(shí)傳代,根據(jù)細(xì)胞生長情況1:2或1:3傳代。傳至第3代時(shí),胰酶消化,收獲細(xì)胞,流式細(xì)胞儀檢測。將收獲的MSCs分入7個(gè)EP管,每管約1×106個(gè)細(xì)胞,分別為CD29及其同型對照管、CD34及其同型對照管、CD45和CD90及其同型對照管,各管內(nèi)加入相應(yīng)標(biāo)記抗體,避光孵育40min后上機(jī)檢測。 3.獲取雄性SD大鼠的MSCs,傳代、增殖、純化。制作大鼠腸I/R模型。將第3代MSCs用4,6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚(DAPI)標(biāo)記,熒光顯微鏡觀察標(biāo)記率。再將MSCs制成細(xì)胞懸液,濃度為1×106/ml,于造模成功后60min,通過尾靜脈注射到大鼠體內(nèi),1ml/只。對照組尾靜脈注射等量生理鹽水。于輸注后6h、24h、72h分批處死大鼠,獲取血液、小腸組織等標(biāo)本。檢測血液IL-6、IL-10、TNF-α、MDA、SOD的濃度。小腸組織部分行快速冰凍,熒光顯微鏡下觀察DAPI陽性細(xì)胞;部分常規(guī)HE染色,觀察腸黏膜受損情況;部分作免疫組化,觀察腸上皮細(xì)胞壞死和增殖修復(fù)情況。 【結(jié)果】 1.夾閉腸系膜前動(dòng)脈后,腸系膜動(dòng)脈搏動(dòng)消失,腸管變白、痙攣、皺縮,約在40min后腸管鼓脹、呈暗紅色,恢復(fù)腸系膜前動(dòng)脈血供后,腸系膜動(dòng)脈恢復(fù)搏動(dòng),腸管恢復(fù)蠕動(dòng),顏色變?yōu)轷r紅色。小腸組織常規(guī)病理鏡下觀察多數(shù)標(biāo)本腸黏膜破損、潰瘍、出血,固有層破壞、毛細(xì)血管暴露,中性粒細(xì)胞大量浸潤,局部出血,甚至有固有層腺體的破壞,腸絨毛萎縮,少數(shù)標(biāo)本病理損傷較輕。Chiu’小腸組織損傷評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)評分為54.83±4.26分。 2.倒置相差顯微鏡觀察原代接種24h即可見較多細(xì)胞貼壁,外觀呈紡錘形和多角形, 72h后細(xì)胞數(shù)量開始增多,細(xì)胞形態(tài)呈成纖維細(xì)胞樣長梭形,培養(yǎng)至9d左右細(xì)胞匯合達(dá)到90%左右,細(xì)胞呈極性排列,集落呈漩渦狀。經(jīng)過換液和傳代后,細(xì)胞逐漸純化,至第3代時(shí),細(xì)胞形態(tài)均一,呈膜狀鋪展。細(xì)胞表面標(biāo)記物經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測,CD29陽性率為98.6%、CD90陽性率99.6%;而CD34、CD45為陰性,陽性率分別為0.56%、0.89%。 3. MSCs輸注治療組大鼠的血清IL-6、TNF-α水平在治療后6h和24h顯著低于對照組(P0.05);血清IL-10則顯著高于對照組(P0.05); MDA水平在各時(shí)間點(diǎn)組間都有顯著性差異(P0.05),SOD在治療后24h組間有顯著性差異(P0.01)。治療組小腸組織熒光顯微鏡下觀察可見DAPI陽性細(xì)胞。病理及免疫組化顯示,治療組腸黏膜損傷在6h、24h較對照組輕,24h和72h治療組腸黏膜組織細(xì)胞增殖較對照組明顯(P0.05)。 【結(jié)論】 1.夾閉腸系膜前動(dòng)脈建立腸I/R模型,可以引起小腸黏膜的壞死、潰瘍、出血;模型穩(wěn)定,適合作為研究對象。 2.全骨髓差異貼壁法能夠獲得較高純度的MSCs,獲得的第3代MSCs純度達(dá)到95%以上,流式細(xì)胞儀鑒定結(jié)果為:CD29陽性率98.6%,CD90陽性率99.6%,CD34、CD45為陰性,陽性率分別為0.89%、0.56%,為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供了充足的MSCs來源。 3.腸I/R I能夠引起大鼠全身性炎癥反應(yīng),于損傷后24h反應(yīng)較明顯,72h逐漸恢復(fù)。移植的MSCs能夠遷移并定居到受損腸道,對腸I/R I有一定的治療作用。MSCs能夠調(diào)節(jié)大鼠腸I/R I后引起的全身性炎癥反應(yīng),抑制炎癥介質(zhì)的過度釋放,促進(jìn)抗炎介質(zhì)的分泌和氧自由基的清除,減輕腸道的免疫損傷,促進(jìn)腸上皮的增殖、腸黏膜的修復(fù),維護(hù)腸屏障功能的完整性。
【圖文】：

表 1-2 I/R 組小腸組織損傷評分表（n=6）編號(hào) 6 個(gè)視野的評分 總和19 11 7 10 11 10 5827 7 9 10 8 7 48311 8 7 7 14 12 59411 9 7 8 10 8 53510 11 9 9 10 9 58610 10 8 8 7 10 53

表 1-2 I/R 組小腸組織損傷評分表（n=6）編號(hào) 6 個(gè)視野的評分 總和19 11 7 10 11 10 5827 7 9 10 8 7 48311 8 7 7 14 12 59411 9 7 8 10 8 53510 11 9 9 10 9 58610 10 8 8 7 10 53
【學(xué)位授予單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R329

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2526311