【摘要】： 目的: 通過對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)免疫耐受作用的初步研究,建立MSCs體外分離、純化及鑒定的方法,為深入研究MSCs及其廣泛應(yīng)用提供基礎(chǔ)。同時,對其免疫調(diào)節(jié)及免疫耐受作用的初步研究,為其在移植領(lǐng)域內(nèi)的廣泛應(yīng)用,提供理論依據(jù)及實驗數(shù)據(jù)。 方法: 1.MSCs體外分離培養(yǎng)、純化及鑒定 (1)細(xì)胞原代培養(yǎng):處死乳鼠,取出骨髓,制成單細(xì)胞懸液,接種于培養(yǎng)瓶,72h后棄除懸浮細(xì)胞,加入新鮮培養(yǎng)液,2-3d換半液一次,至細(xì)胞鋪滿單層,一般時間約1w。 (2)傳代:棄去培養(yǎng)液,用胰酶消化,倒出消化液,血清終止,倒出培養(yǎng)液,吹打貼壁細(xì)胞,制成細(xì)胞懸液,顯微鏡每天觀察,一直到貼壁細(xì)胞融合鋪滿瓶底為止,進(jìn)行反復(fù)傳代擴(kuò)增。每次傳代嚴(yán)格控制酶的量和消化時間,以達(dá)到純化MSCs的目的。 (3)生長曲線測定:取生長良好的1,3,5代細(xì)胞,胰蛋白酶消化后,制成單細(xì)胞懸液,接種于96孔板,24h后,加入DMSO后,酶標(biāo)儀計數(shù),計算均值,連續(xù)6d,每天計數(shù),最后以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo),OD值為縱坐標(biāo),繪制出生長曲線。 (4)細(xì)胞周期的測定 取生長比較好的三代細(xì)胞,胰酶消化后,制成單細(xì)胞懸液,采用流式細(xì)胞儀直接熒光法檢測細(xì)胞周期。用激發(fā)光源為15mW氬離子的激光,波長為488nm。FACS軟件收集細(xì)胞,Lysis軟件分析處理數(shù)據(jù)后,記錄陽性細(xì)胞百分率。 (5)細(xì)胞生長狀態(tài)觀察 在細(xì)胞培養(yǎng)過程中,在倒置顯微鏡下每天觀察細(xì)胞生長、增殖情況及形態(tài)特征,并隨時拍照記錄。 2.MSCs免疫原性研究 MSCs表面表達(dá)很多粘附分子,包括參與T淋巴細(xì)相互作用的VCAM-1,CAM-1和LFA3,MSC不表達(dá)MHCⅡ分子,Fasl。不表達(dá)或極低水平表達(dá)MHCⅠ。.MSCs不易被宿主T細(xì)胞識別,并能逃脫宿主免疫系統(tǒng)的排斥。本實驗用免疫組化染色方法測定。 3.MSCs對免疫反應(yīng)的抑制作用 MSCs通過抑制細(xì)胞間相互接觸,阻礙了T細(xì)胞與抗原提呈細(xì)胞的接觸,從而抑制了T細(xì)胞的增殖.本實驗用胸腺細(xì)胞自發(fā)增殖活性測定。 4.胸腺細(xì)胞自發(fā)增殖活性測定 取出MSCs制備單細(xì)胞懸液,調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度加入96孔培養(yǎng)板中,每一樣本作6復(fù)孔,第二天在已加入MSCs的96孔培養(yǎng)板中再加上述制備好的胸腺細(xì)胞懸液,培養(yǎng)箱培養(yǎng),收集胸腺細(xì)胞加入MTT,等到時間后加入DMSO后,上機(jī)檢測。 結(jié)果: 1.MSCs體外培養(yǎng)情況和形態(tài)學(xué)特征 接種的骨髓細(xì)胞,初始主要為造血細(xì)胞,形態(tài)多樣。培養(yǎng)4天后,可見貼壁細(xì)胞,傳代后,開始出現(xiàn)梭形或紡錘形成纖維樣細(xì)胞,突起變大。一周后,細(xì)胞融合成單層,梭形細(xì)胞突起明顯粗大,細(xì)胞呈漩渦狀排列。2-3代后,細(xì)胞形態(tài)變得較為均一,絕大部分為細(xì)長梭形細(xì)胞,也有扁平形帶突起的細(xì)胞,似成纖維樣細(xì)胞,細(xì)胞可散在生長,也有呈克隆樣生長。細(xì)胞傳代6-7代以后,形態(tài)無明顯變化,但是扁平形的大細(xì)胞增多,梭形細(xì)胞減少。6-7代以后,細(xì)胞生長有老化現(xiàn)象。 2.MSCs生長曲線 細(xì)胞分裂起始比較慢,經(jīng)過潛伏期以后,進(jìn)入對數(shù)生長期,然后幾天后進(jìn)入平臺期。 3.MSC細(xì)胞周期 流式細(xì)胞儀直接熒光法,檢測細(xì)胞周期,記錄陽性細(xì)胞百分率,見73.18%的細(xì)胞處于G_0/G_1期,結(jié)果表明檢測的細(xì)胞具有MSCs的生長特性。 4.MSC分化為成骨細(xì)胞:先誘導(dǎo)再用堿性磷酸酶染色 5.大鼠MSCs表面MHCⅡ、MHCⅠ類分子的鑒定:采用免疫組織化學(xué)染色方法,在光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞染色情況。細(xì)胞核中有棕黃色顆粒者為陽性細(xì)胞。 6.大鼠MSCs對異基因大鼠T淋巴細(xì)胞的增殖抑制作用:見柱狀圖(圖3.9-3.17) 結(jié)論: 1.MSCs的分離培養(yǎng)、純化及鑒定:細(xì)胞分裂初期比較緩慢,經(jīng)過一段時間的潛伏期后,進(jìn)入對數(shù)生長期。然后進(jìn)入平臺期。MSCs可分化為成骨細(xì)胞,MSCs沒有明顯的形態(tài)學(xué)特征及特異性表面標(biāo)志。 2.MSCs免疫原性研究:MSC具有低免疫原性:不表達(dá)MHCⅡ,極低表達(dá)MHCⅠ類分子,能逃脫免疫排斥。實驗數(shù)據(jù)見(圖3.5-3.8) 3.MSCs免疫抑制作用:大鼠MSCs對異基因大鼠T淋巴細(xì)胞的增殖抑制:隨著時間的延長,耐受作用越明顯。隨著MSCS數(shù)目的增多,耐受作用越明顯實驗表見(圖3.9-3.17)
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R392

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前7條

1 丁剛;劉怡;王松靈;;間充質(zhì)干細(xì)胞的免疫學(xué)特性[J];北京口腔醫(yī)學(xué);2008年02期

2 謝燕丹;劉元生;;骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在骨髓移植中的應(yīng)用[J];廣西醫(yī)學(xué);2007年02期

3 劉斌鈺;李寧毅;樊功為;金曉明;陳立強(qiáng);;大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)鑒定及向成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化研究[J];齊魯醫(yī)學(xué)雜志;2007年03期

4 李秀東;劉雅娟;陳強(qiáng);宋祥福;張紅梅;陳玉丙;;小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對異基因肝移植大鼠淋巴細(xì)胞增殖的抑制作用[J];中國生物制品學(xué)雜志;2008年04期

5 連霞;李光來;;骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性及其多向分化潛能的理論基礎(chǔ)和機(jī)制[J];臨床醫(yī)藥實踐;2006年03期

6 邱林;金先慶;;骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性及其臨床治療應(yīng)用[J];中國組織工程研究與臨床康復(fù);2008年12期

7 都義日,付小兵,李存保;骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的研究進(jìn)展[J];中國危重病急救醫(yī)學(xué);2004年08期

，

本文編號：2520589