【摘要】：瘋草是全球危害最嚴(yán)重的一類有毒植物,常引起大量的家畜死亡,孕畜流產(chǎn)、早產(chǎn)、死胎以及胎兒發(fā)育不良,空懷率高,公畜不育等,給畜牧業(yè)造成巨大的損失。為此,人們通過(guò)挖除瘋草、生物防除、化學(xué)滅除、添加解毒劑和輪牧等許多措施,以期降低瘋草的危害,然而直到目前為止,這一問(wèn)題一直沒(méi)有得到徹底解決。研究證明,苦馬豆素(Swainsonine, SW)是瘋草中的主要有毒成分。人們對(duì)SW的理化性質(zhì)、中毒機(jī)理、藥理活性和毒理學(xué)等進(jìn)行了大量研究,而如何通過(guò)免疫的方法預(yù)防動(dòng)物瘋草中毒已成為目前研究的熱點(diǎn)。本研究選擇對(duì)氯甲基苯甲酸作為SW半抗原和牛血清白蛋白(BSA)載體之間的間隔臂,化學(xué)合成了SW-BSA人工抗原,并進(jìn)行了人工合成抗原中SW與BSA最佳結(jié)合比的篩選、免疫佐劑的選擇以及對(duì)家兔和山羊的免疫學(xué)研究,獲得以下結(jié)果: 1.根據(jù)液液萃取時(shí)不同物質(zhì)的分散原理,優(yōu)化了從瘋草有毒植物中提取SW的生產(chǎn)工藝,使SW的提取率顯著提高,從變異黃芪和甘肅棘豆的提取率分別達(dá)到50 mg/kg和64 mg/kg以上,為SW的進(jìn)一步研究提供了首要條件。 2.引入對(duì)氯甲基苯甲酸作為SW與BSA之間偶聯(lián)的間隔臂,通過(guò)化學(xué)合成的方法,先合成SW的季銨鹽化合物,波普分析各步反應(yīng)為目標(biāo)化合物后,再用EDC法與BSA偶聯(lián)得到SW-BSA人工抗原,紫外光譜檢測(cè)偶聯(lián)成功。 3.紫外光譜法測(cè)定了4種SW-BSA人工合成抗原中SW與BSA的結(jié)合比分別為14.7、20.2、25.3和32.6。并對(duì)小鼠進(jìn)行免疫試驗(yàn),間接EILSA檢測(cè)結(jié)果表明,4種偶聯(lián)率的SW-BSA人工合成抗原對(duì)小鼠都產(chǎn)生了較高效價(jià)的抗體,其中以偶聯(lián)比為20.2的免疫效價(jià)最高,由此說(shuō)明SW-BSA人工合成抗原的最佳偶聯(lián)率為20.2。 4.以偶聯(lián)比為20.2的SW-BSA為免疫原,分別制備弗氏佐劑疫苗、蜂膠佐劑疫苗和白油佐劑疫苗,并對(duì)家兔進(jìn)行免疫試驗(yàn),間接ELISA檢測(cè)血清效價(jià)表明弗氏佐劑疫苗和白油佐劑疫苗都產(chǎn)生了較高的免疫效價(jià)。由于弗氏佐劑疫苗的副作用大,一般僅用于試驗(yàn)研究,所以本試驗(yàn)選擇白油佐劑疫苗作進(jìn)一步的免疫學(xué)研究,以為生產(chǎn)實(shí)踐提供依據(jù)。 同時(shí),間接ELISA阻斷試驗(yàn)和瓊脂雙向擴(kuò)散試驗(yàn)表明,家兔體內(nèi)產(chǎn)生了針對(duì)SW的特異性抗體。 5.家兔血清加入丙酮,經(jīng)過(guò)超聲和離心凈化處理,冷凍干燥后硅烷化試劑衍生化,建立了氣相色譜分析家兔血清中SW的方法。本方法的線性范圍為0.000 08 g/L～2.5 g/L,相關(guān)系數(shù)γ= 0.999 6,在0.001 g/L～1.0 g/L 4個(gè)水平上加標(biāo)回收率為89.81%～96.23%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.46%～4.35%。該方法適用于家兔血清中苦馬豆素含量的測(cè)定。 6.SW-BSA白油佐劑疫苗免疫家兔2次,間接ELISA法檢測(cè)血清抗體效價(jià)的變化,抗體效價(jià)達(dá)到較高后進(jìn)行甘肅棘豆(10 g/kg/d)攻毒試驗(yàn),同時(shí)檢測(cè)血清各項(xiàng)生化指標(biāo)。試驗(yàn)結(jié)果表明,免疫攻毒組家兔的臨床中毒癥狀比攻毒對(duì)照組出現(xiàn)時(shí)間延遲30 d,血清中SW濃度比攻毒對(duì)照組延緩21 d達(dá)到較高水平,血清中AST、ALP、LDH、BUN活性比攻毒對(duì)照組延緩31 d達(dá)到較高值,血清α-mannosidase的活性比攻毒對(duì)照組延緩28 d下降到較低值,家兔各個(gè)組織器官的病理變化主要是以細(xì)胞呈現(xiàn)急性中毒性缺血缺氧和空泡變性為特點(diǎn)。 7.SW-BSA疫苗免疫山羊2次,間接ELISA法檢測(cè)血清抗體效價(jià)的變化,抗體效價(jià)達(dá)到較高后進(jìn)行甘肅棘豆(10 g/kg/d)攻毒飼喂試驗(yàn),同時(shí)檢測(cè)血清各項(xiàng)生化指標(biāo)。試驗(yàn)結(jié)果表明,攻毒組山羊于攻毒后15 d～20 d出現(xiàn)典型的中毒癥狀,免疫攻毒組于50 d～55 d出現(xiàn)中毒癥狀,比攻毒對(duì)照組延緩30 d～40 d;攻毒后,攻毒對(duì)照組山羊血液中生化指標(biāo)迅速改變,而免疫攻毒組表現(xiàn)漸進(jìn)性變化,其中SW濃度、AST、ALP、LDH、BUN、α-mannosidase活性分別比攻毒對(duì)照組延緩27 d、24 d、27 d、30 d、24 d、30 d達(dá)到較高或較低點(diǎn);中毒山羊組織器官出現(xiàn)以急性中毒性缺血缺氧和空泡變性為特點(diǎn)的病理變化,與家兔的基本一致。 以上結(jié)果表明,SW-BSA人工合成抗原疫苗對(duì)家兔和山羊具有一定的保護(hù)作用,能夠延緩瘋草中毒時(shí)間30 d～40 d,為SW-BSA疫苗的臨床應(yīng)用提供了試驗(yàn)依據(jù)。
【圖文】：

盡管苦馬豆素能引起肝、腎實(shí)質(zhì)細(xì)胞空泡變性，但低聚糖僅蓄積于腎在 1983 年就由 Sadeh S 等[120]從綿羊瘋草中毒的尿中分離得到。以后到這種低聚糖[121]。馬豆素的中毒機(jī)理認(rèn)為苦馬豆素引起動(dòng)物中毒，主要由于其作用于甘露糖甙酶（mannos，可抑制溶酶體 α-甘露糖甙酶 I 和高爾基氏體 α-甘露糖甙酶 II 的活性酶活性受抑制后可導(dǎo)致部分合成的低聚糖在溶酶體內(nèi)聚積；高爾基氏酶 II 受抑制，可導(dǎo)致糖蛋白合成異常。ani(1982)發(fā)現(xiàn)，苦馬豆素是高爾基氏體甘露糖甙酶 II 的高效抑制劑，，甙酶 IA 和 IB。隨后，Kang 和 Elbein(1983)也進(jìn)一步證明了苦馬豆素，即使很高濃度也不能抑制 β-甘露糖甙酶、α 或 β 葡萄糖甙酶、α 或氨基已糖甙酶和 α-果糖甙酶。認(rèn)為，苦馬豆素的抑制活性是由于苦馬豆素陽(yáng)離子同甘露糖甙水解過(guò)陽(yáng)離子的半椅狀空間結(jié)構(gòu)上的相似性(圖 2-2)，以及對(duì)甘露糖甙酶的

圖 6-2 1:化合物 III；2:化合物 II；3:化合物 IFig.6-2 1:compound III; 2:compound II; 3 compound I圖 6-2）。質(zhì)譜測(cè)定其分子量為 322（見(jiàn)附錄 I），與理論值一致。物 III 的合成，經(jīng)純化后得到 30 mg，得率為 68.2%，經(jīng) CHCl3:CH3Om 紫外檢測(cè)顯熒光，Rf = 0.06（見(jiàn)圖 6-2）。質(zhì)譜測(cè)定其分子量為 3論值一致。
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R392

【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 宋毓民;唐嶺田;王建華;唐金寧;王愛(ài)華;王研;;SW-BSA人工抗原疫苗對(duì)家兔的免疫效果[J];中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào);2012年05期

2 宋毓民;唐金寧;王愛(ài)華;王妍;王建華;;SW-BSA人工抗原疫苗對(duì)山羊的免疫評(píng)價(jià)[J];中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào);2014年07期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前2條

1 王妍;苦馬豆素降解菌HW 08的分離及其特性研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2011年

2 楊國(guó)棟;瘋草內(nèi)生真菌合成苦馬豆素的研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2012年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前2條

1 陳婷婷;計(jì)算機(jī)模擬輔助氯霉素人工抗原的設(shè)計(jì)與合成[D];南昌大學(xué);2011年

2 榮杰;甘肅棘豆對(duì)大鼠亞急性毒性及α-甘露糖苷酶分布與表達(dá)的影響[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2011年

本文編號(hào)：2519902