發(fā)布時間：2019-07-27 09:04

【摘要】：瘋草是全球危害最嚴重的一類有毒植物,常引起大量的家畜死亡,孕畜流產(chǎn)、早產(chǎn)、死胎以及胎兒發(fā)育不良,空懷率高,公畜不育等,給畜牧業(yè)造成巨大的損失。為此,人們通過挖除瘋草、生物防除、化學滅除、添加解毒劑和輪牧等許多措施,以期降低瘋草的危害,然而直到目前為止,這一問題一直沒有得到徹底解決。研究證明,苦馬豆素(Swainsonine, SW)是瘋草中的主要有毒成分。人們對SW的理化性質(zhì)、中毒機理、藥理活性和毒理學等進行了大量研究,而如何通過免疫的方法預防動物瘋草中毒已成為目前研究的熱點。本研究選擇對氯甲基苯甲酸作為SW半抗原和牛血清白蛋白(BSA)載體之間的間隔臂,化學合成了SW-BSA人工抗原,并進行了人工合成抗原中SW與BSA最佳結合比的篩選、免疫佐劑的選擇以及對家兔和山羊的免疫學研究,獲得以下結果: 1.根據(jù)液液萃取時不同物質(zhì)的分散原理,優(yōu)化了從瘋草有毒植物中提取SW的生產(chǎn)工藝,使SW的提取率顯著提高,從變異黃芪和甘肅棘豆的提取率分別達到50 mg/kg和64 mg/kg以上,為SW的進一步研究提供了首要條件。 2.引入對氯甲基苯甲酸作為SW與BSA之間偶聯(lián)的間隔臂,通過化學合成的方法,先合成SW的季銨鹽化合物,波普分析各步反應為目標化合物后,再用EDC法與BSA偶聯(lián)得到SW-BSA人工抗原,紫外光譜檢測偶聯(lián)成功。 3.紫外光譜法測定了4種SW-BSA人工合成抗原中SW與BSA的結合比分別為14.7、20.2、25.3和32.6。并對小鼠進行免疫試驗,間接EILSA檢測結果表明,4種偶聯(lián)率的SW-BSA人工合成抗原對小鼠都產(chǎn)生了較高效價的抗體,其中以偶聯(lián)比為20.2的免疫效價最高,由此說明SW-BSA人工合成抗原的最佳偶聯(lián)率為20.2。 4.以偶聯(lián)比為20.2的SW-BSA為免疫原,分別制備弗氏佐劑疫苗、蜂膠佐劑疫苗和白油佐劑疫苗,并對家兔進行免疫試驗,間接ELISA檢測血清效價表明弗氏佐劑疫苗和白油佐劑疫苗都產(chǎn)生了較高的免疫效價。由于弗氏佐劑疫苗的副作用大,一般僅用于試驗研究,所以本試驗選擇白油佐劑疫苗作進一步的免疫學研究,以為生產(chǎn)實踐提供依據(jù)。 同時,間接ELISA阻斷試驗和瓊脂雙向擴散試驗表明,家兔體內(nèi)產(chǎn)生了針對SW的特異性抗體。 5.家兔血清加入丙酮,經(jīng)過超聲和離心凈化處理,冷凍干燥后硅烷化試劑衍生化,建立了氣相色譜分析家兔血清中SW的方法。本方法的線性范圍為0.000 08 g/L～2.5 g/L,相關系數(shù)γ= 0.999 6,在0.001 g/L～1.0 g/L 4個水平上加標回收率為89.81%～96.23%,相對標準偏差為2.46%～4.35%。該方法適用于家兔血清中苦馬豆素含量的測定。 6.SW-BSA白油佐劑疫苗免疫家兔2次,間接ELISA法檢測血清抗體效價的變化,抗體效價達到較高后進行甘肅棘豆(10 g/kg/d)攻毒試驗,同時檢測血清各項生化指標。試驗結果表明,免疫攻毒組家兔的臨床中毒癥狀比攻毒對照組出現(xiàn)時間延遲30 d,血清中SW濃度比攻毒對照組延緩21 d達到較高水平,血清中AST、ALP、LDH、BUN活性比攻毒對照組延緩31 d達到較高值,血清α-mannosidase的活性比攻毒對照組延緩28 d下降到較低值,家兔各個組織器官的病理變化主要是以細胞呈現(xiàn)急性中毒性缺血缺氧和空泡變性為特點。 7.SW-BSA疫苗免疫山羊2次,間接ELISA法檢測血清抗體效價的變化,抗體效價達到較高后進行甘肅棘豆(10 g/kg/d)攻毒飼喂試驗,同時檢測血清各項生化指標。試驗結果表明,攻毒組山羊于攻毒后15 d～20 d出現(xiàn)典型的中毒癥狀,免疫攻毒組于50 d～55 d出現(xiàn)中毒癥狀,比攻毒對照組延緩30 d～40 d;攻毒后,攻毒對照組山羊血液中生化指標迅速改變,而免疫攻毒組表現(xiàn)漸進性變化,其中SW濃度、AST、ALP、LDH、BUN、α-mannosidase活性分別比攻毒對照組延緩27 d、24 d、27 d、30 d、24 d、30 d達到較高或較低點;中毒山羊組織器官出現(xiàn)以急性中毒性缺血缺氧和空泡變性為特點的病理變化,與家兔的基本一致。 以上結果表明,SW-BSA人工合成抗原疫苗對家兔和山羊具有一定的保護作用,能夠延緩瘋草中毒時間30 d～40 d,為SW-BSA疫苗的臨床應用提供了試驗依據(jù)。
【圖文】：

盡管苦馬豆素能引起肝、腎實質(zhì)細胞空泡變性，但低聚糖僅蓄積于腎在 1983 年就由 Sadeh S 等[120]從綿羊瘋草中毒的尿中分離得到。以后到這種低聚糖[121]。馬豆素的中毒機理認為苦馬豆素引起動物中毒，主要由于其作用于甘露糖甙酶（mannos，可抑制溶酶體 α-甘露糖甙酶 I 和高爾基氏體 α-甘露糖甙酶 II 的活性酶活性受抑制后可導致部分合成的低聚糖在溶酶體內(nèi)聚積；高爾基氏酶 II 受抑制，可導致糖蛋白合成異常。ani(1982)發(fā)現(xiàn)，苦馬豆素是高爾基氏體甘露糖甙酶 II 的高效抑制劑，，甙酶 IA 和 IB。隨后，Kang 和 Elbein(1983)也進一步證明了苦馬豆素，即使很高濃度也不能抑制 β-甘露糖甙酶、α 或 β 葡萄糖甙酶、α 或氨基已糖甙酶和 α-果糖甙酶。認為，苦馬豆素的抑制活性是由于苦馬豆素陽離子同甘露糖甙水解過陽離子的半椅狀空間結構上的相似性(圖 2-2)，以及對甘露糖甙酶的

圖 6-2 1:化合物 III；2:化合物 II；3:化合物 IFig.6-2 1:compound III; 2:compound II; 3 compound I圖 6-2）。質(zhì)譜測定其分子量為 322（見附錄 I），與理論值一致。物 III 的合成，經(jīng)純化后得到 30 mg，得率為 68.2%，經(jīng) CHCl3:CH3Om 紫外檢測顯熒光，Rf = 0.06（見圖 6-2）。質(zhì)譜測定其分子量為 3論值一致。
【學位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2009
【分類號】：R392

【引證文獻】

相關期刊論文 前2條

1 宋毓民;唐嶺田;王建華;唐金寧;王愛華;王研;;SW-BSA人工抗原疫苗對家兔的免疫效果[J];中國獸醫(yī)學報;2012年05期

2 宋毓民;唐金寧;王愛華;王妍;王建華;;SW-BSA人工抗原疫苗對山羊的免疫評價[J];中國獸醫(yī)學報;2014年07期

相關博士學位論文 前2條

1 王妍;苦馬豆素降解菌HW 08的分離及其特性研究[D];西北農(nóng)林科技大學;2011年

2 楊國棟;瘋草內(nèi)生真菌合成苦馬豆素的研究[D];西北農(nóng)林科技大學;2012年

相關碩士學位論文 前2條

1 陳婷婷;計算機模擬輔助氯霉素人工抗原的設計與合成[D];南昌大學;2011年

2 榮杰;甘肅棘豆對大鼠亞急性毒性及α-甘露糖苷酶分布與表達的影響[D];西北農(nóng)林科技大學;2011年

本文編號：2519902