【摘要】： 前言 NKT細胞TCR識別由非胸腺依賴抗原與CDld結(jié)合而成的復(fù)合物。α-GalCer為目前發(fā)現(xiàn)的NKT細胞結(jié)合效能最強的糖脂抗原,其可以裝載入CDld分子抗原結(jié)合溝槽,應(yīng)用此糖脂和分子所建立的CDld四聚體技術(shù)是檢測NKT細胞的權(quán)威方法。 肝臟是機體最大的消化與代謝器官,然而其在免疫學(xué)領(lǐng)域的作用日漸清晰,甚至有人已把肝臟作為獨立的免疫器官；NKT細胞在肝內(nèi)單個核細胞比率達到8%-15%,為所有具備淋巴樣器官中最多的器官。本試驗即利用肝臟內(nèi)NKT細胞比率較高的特性,以評定不同制備條件建立的四聚體檢測效果,從而對其制備條件進行改良。不同肝臟單個核細胞制備方法可對NKT細胞比率產(chǎn)生影響,選擇一種穩(wěn)定的制備方法也是保證改良方案實施的重要基礎(chǔ)。 Tween-20是常用的實驗室有機助溶劑,屬水包油型乳化劑,可用作增溶劑、擴散劑、穩(wěn)定劑、潤滑劑和抗靜電劑。CDld四聚體在制備過程中用含有Tween-20的PBS分散糖脂抗原是能否建立成功四聚體的關(guān)鍵步驟,但其亦能對反應(yīng)體系造成不利影響,因而在保證其分散效果的同時也應(yīng)該控制Tween-20在整個反應(yīng)體系里的量才能找到一個理想的平衡點。a-GalCer與融合蛋白的孵育時間是CDld四聚體制備過程的限速步驟,現(xiàn)今的制作流程中二者的孵育時間皆在12小時以上,這完全限制了CDld四聚體技術(shù)的快速應(yīng)用。 本研究建立的CDld四聚體技術(shù)可對小鼠胸腺、脾臟、肝臟iNKT細胞進行檢測,并對CDld四聚體制作過程的PBS所含Tween-20濃度及a-GalCer與融合蛋白的孵育時間進行摸索,希求應(yīng)用最少的Tween-20及最短的孵育時間達到良好穩(wěn)定的檢測效果的目的。 方法 以肝臟內(nèi)單個核細胞為檢測對象,利用含Tween-20不同濃度PBS所建立CDld四聚體檢測其NKT比率,通過對比Tween-20濃度不同對CDld四聚體檢測效率的差異,確定最合理的Tween-20濃度；以肝臟內(nèi)單個核細胞為檢測對象,利用糖脂a-GalCer與CDld-IgG1 Fc融合蛋白經(jīng)不同孵育時間所建立CDld四聚體對其NKT比率進行檢測,通過對比孵育時間的不同對CDld四聚體檢測效率的差異,確定最合理的孵育時間。 結(jié)果 CDld四聚體檢測NKT方法的建立應(yīng)用保守建立方法,即用含Tween-201%的PBS稀釋a-GalCer糖脂儲存液,并與CDld-IgG1 Fc融合蛋白孵育過夜12小時所建立的四聚體檢測液對所提純肝臟單個核細胞、胸腺細胞、脾臟單個核細胞進行檢測,可檢測到NKT細胞亞群,其檢測陽性比率與國外文獻相符,表明四聚體建立成功。 用含不同濃度Tween-20 PBS (0.00%、0.05%、0.10%、0.25%.0.50%、1.00%、2.00%)制備的CDld四聚體檢測肝臟單個核細胞內(nèi)NKT細胞,對其檢測效率進行比較,在0.5%至2%范圍內(nèi)增加時,所測得NKT細胞比率稍有下降趨勢或比率相當(dāng),統(tǒng)計學(xué)處理Tween-20濃度在0.5、1%、2%時,三者的檢出能力無統(tǒng)計學(xué)差異,顯示Tween-20在0.5%時即能制備出具有完整檢出能力的CDld四聚體。 不同糖脂a-GalCer與CDld-IgG1 Fc融合蛋白裝載時間(1h、2h、4h、6h、8h、12h、24h)所制備的CDld四聚體檢測肝臟單個核細胞內(nèi)NKT細胞,對其檢測效率進行比較。數(shù)據(jù)表明,隨裝載時間在1h、2h、4h、6h、8h范圍內(nèi)不斷增加,所測得NKT細胞比率不斷增加；在8h、12h、24h范圍內(nèi)增加時,所測得NKT細胞比率稍有下降趨勢或比率相當(dāng),統(tǒng)計學(xué)處理裝載時間在8h、12h、24h時,三者的檢出能力無統(tǒng)計學(xué)差異,顯示裝載時間8h時即能制備出具有完整檢出能力的四聚體。 結(jié)論 建立CDld四聚體檢測技術(shù),可以對肝臟、胸腺、脾臟NKT細胞進行檢測。在CDld四聚體制備過程中,用于分散a-CalCer糖脂抗原的PBS所含Tween-20的濃度可降低到0.5%。在CDld四聚體制備過程中,a-CalCer和CDld-IgG1 Fc融合蛋白的孵育時間可縮短到8h。
【圖文】：

Y6T細胞及B細胞在肝臟單個核細胞比率2、CDld四聚體檢測NKT方法的建立應(yīng)用保守建立方法，即用含T切een一201%的PBS稀釋糖脂儲存液，并cDld一lgGIFc融合蛋白孵育過夜12小時所建立的四聚體檢測液對所提純肝臟個核細胞、胸腺細胞、脾臟單個核細胞進行檢測，，可檢測到NKT細胞亞群，其測陽性比率與國外文獻相符，表明四聚體建立成功。所得NKT細胞比率如圖所

四聚體檢測胸腺細胞NKT細胞比率(左為對照，右為CD4、CDld四聚體雙染)注:Ql十QZ區(qū)為四聚體陽性區(qū)
【學(xué)位授予單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R392-3

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前3條

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2 劉景華;竇立萍;王莉莉;于力;;CD1d四聚體檢測NKT細胞[J];細胞與分子免疫學(xué)雜志;2009年01期

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本文編號：2519784