發(fā)布時(shí)間：2019-06-02 23:28

【摘要】： 目前,神經(jīng)干細(xì)胞(Neural stem cells, NSCs)的體外培養(yǎng)主要采用懸浮培養(yǎng)和貼壁培養(yǎng)體系,然而這兩種培養(yǎng)體系都存在無法模擬體內(nèi)NSCs生長微環(huán)境的缺點(diǎn)。而三維的細(xì)胞培養(yǎng)體系能夠?yàn)榧?xì)胞提供良好的生長環(huán)境,促進(jìn)細(xì)胞分泌細(xì)胞外基質(zhì),從而形成與體內(nèi)組織相近的結(jié)構(gòu)。因此,本研究采用三維培養(yǎng)體系來培養(yǎng)NSCs,并構(gòu)建出類神經(jīng)組織結(jié)構(gòu)。 實(shí)驗(yàn)以大鼠海馬腦組織來源的NSCs為種子細(xì)胞,選用天然生物材料-膠原水凝膠為支架材料。首先對(duì)膠原內(nèi)呈三維生長的細(xì)胞與傳統(tǒng)單層培養(yǎng)細(xì)胞及懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的生長和代謝情況進(jìn)行比較。進(jìn)而采用先期使用增殖培養(yǎng)基、后期使用分化培養(yǎng)基的策略,使NSCs在膠原水凝膠內(nèi)先增殖然后向神經(jīng)細(xì)胞分化,形成相互連接的類神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。采用cck-8試劑盒(Cell counting kit-8)對(duì)所構(gòu)建的三維網(wǎng)絡(luò)內(nèi)細(xì)胞的增殖情況進(jìn)行檢測；使用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察所構(gòu)建的三維類網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)內(nèi)經(jīng)死活染色和免疫熒光染色后的細(xì)胞生長和分化情況。最后,對(duì)三維灌注式培養(yǎng)NSCs進(jìn)行了初步的研究。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,膠原內(nèi)三維培養(yǎng)的NSCs增殖倍數(shù)最大,4 d內(nèi)可達(dá)70倍,而普通懸浮培養(yǎng)和單層培養(yǎng)的擴(kuò)增倍數(shù)分別為2.5倍和35倍。葡萄糖和乳酸代謝檢測結(jié)果表明,膠原內(nèi)細(xì)胞的葡萄糖比消耗速率最小,比消耗速率曲線最平緩,且乳酸的比生成速率也最小。細(xì)胞-膠原構(gòu)建物體外培養(yǎng)42 d后,構(gòu)建物內(nèi)的細(xì)胞活率維持在82%左右,細(xì)胞在構(gòu)建物內(nèi)分布較均勻,而且能夠分化成神經(jīng)元、星型膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞。此外,層粘連蛋白(Laminin, LN)預(yù)處理膠原蛋白海綿支架內(nèi)NSCs的接種率(55.8±1.21%)較單純用培養(yǎng)基處理的支架內(nèi)接種率(43.1±1.18%)有顯著提高。最后,灌注式生物反應(yīng)器培養(yǎng)條件下,NSCs在支架中呈團(tuán)簇生長、分布均勻、且陽性表達(dá)Nestin；灌注式三維培養(yǎng)利于細(xì)胞營養(yǎng)物質(zhì)的供應(yīng),能夠使pH值維持在細(xì)胞正常的耐受范圍。 由以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果我們得出以下結(jié)論：膠原內(nèi)的三維培養(yǎng)條件更加利于NSCs的增殖和代謝,而且本研究所獲得的三維組織構(gòu)建物在形態(tài)、細(xì)胞構(gòu)成等方面均與神經(jīng)組織相類似；經(jīng)LN預(yù)處理的膠原蛋白海綿支架更利于NSCs的粘附,可提高細(xì)胞在支架上的接種率；灌注式生物反應(yīng)器培養(yǎng)條件有助于NSCs在支架中均勻分布和增殖,保持NSCs的特性。
[Abstract]:At present, the culture of neural stem cell (Neural stem cells, NSCs) in vitro mainly adopts suspension culture and adherent culture system. However, these two culture systems can not simulate the growth microenvironment of NSCs in vivo. The three-dimensional cell culture system can provide a good growth environment for cells and promote the secretion of extracellular matrix, thus forming a structure similar to that of in vivo tissues. Therefore, in this study, three-dimensional culture system was used to culture NSCs, and construct neural tissue structure. In this experiment, NSCs from rat hippocampal brain tissue was used as seed cell, and collagen hydrogel, a natural biomaterial, was used as scaffold material. Firstly, the growth and metabolism of three-dimensional growth cells in collagen were compared with those of traditional monolayer cells and suspension culture cells. Then the strategy of using proliferation medium in advance and differentiation medium in the later stage was used to make NSCs proliferate first in collagen hydrogel and then differentiate into nerve cells to form a connected neural network. The proliferation of cells in the constructed three-dimensional network was detected by cck-8 kit (Cell counting kit-8). Laser scanning confocal microscope was used to observe the growth and differentiation of cells in the constructed three-dimensional network structure after dead and alive staining and immunofluorescence staining. Finally, the three-dimensional perfusion culture of NSCs was studied. The results showed that the proliferation multiple of NSCs in collagen three-dimensional culture was the highest, which could reach 70 times in 4 days, while the amplification multiple of common suspension culture and monolayer culture was 2.5 times and 35 times, respectively. The results of glucose and lactic acid metabolism showed that the specific consumption rate of glucose in collagen cells was the smallest, the specific consumption rate curve was the slowest, and the specific production rate of lactic acid was the smallest. After 42 days of culture in vitro, the cell survival rate in the construct was about 82%, and the cells were evenly distributed in the construct, and could differentiate into neurons, star glial cells and oligodendrocytes. In addition, the vaccination rate of NSCs in collagen sponge scaffold pretreated with laminin (Laminin, LN) (55.8 鹵1.21%) was significantly higher than that treated with medium alone (43.1 鹵1.18%). Finally, under the condition of perfusion bioreactor, NSCs grew in clusters and distributed evenly in the scaffold, and the three-dimensional culture with positive expression of Nestin; was beneficial to the supply of cell nutrients, and the pH value could be maintained in the normal tolerance range of cells. From the above experimental results, we draw the following conclusions: the three-dimensional culture conditions in collagen are more conducive to the proliferation and metabolism of NSCs, and the three-dimensional tissue structures obtained in this study are similar to nerve tissue in morphology and cell composition. The collagen sponge scaffold pretreated with LN is more beneficial to the adhesion of NSCs and can improve the inoculum rate of cells on the scaffold, and the culture conditions of perfusion bioreactor are helpful to the uniform distribution and proliferation of NSCs in the scaffold and to maintain the characteristics of NSCs.
【學(xué)位授予單位】：大連理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R329

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本文編號(hào)：2491504