【摘要】：目的 分別構(gòu)建T-bet和Ag85B真核表達(dá)質(zhì)粒,將T-bet質(zhì)粒作為基因佐劑與Ag85B質(zhì)粒分子配伍構(gòu)建新型DNA疫苗,并通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)觀察其免疫調(diào)控作用,為結(jié)核等Thl失衡性疾病的防治提供新的理論與實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法 1.根據(jù)GenBank報(bào)道的目的基因(Ag85B和T-bet基因)全長(zhǎng)序列和pcDNA3.1(-)、pET-28a(+)質(zhì)粒酶切位點(diǎn)的特點(diǎn),用DNAClub和Premier Primer5軟件設(shè)計(jì)特異性引物。PCR擴(kuò)增出Ag85B和T-bet基因,分別利用限制性內(nèi)切酶BamU Ⅰ、HindⅢ和Xho Ⅰ、 EcoR Ⅰ對(duì)相應(yīng)PCR產(chǎn)物和空質(zhì)粒pcDNA3.1(-)同時(shí)進(jìn)行雙酶切,純化酶切產(chǎn)物,利用連接酶連接,經(jīng)菌液PCR、酶切及測(cè)序鑒定重組質(zhì)粒pcDNA3.1(-)-Ag85B和pcDNA3.1(-)-T-bet。 2.將上述成功獲得的重組質(zhì)粒pcDNA3.1(-)-Ag85B經(jīng)雙酶切后,將酶切獲得的Ag85B基因亞克隆至原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+),回收目的基因與載體片段后酶連,轉(zhuǎn)化DH5a篩選重組質(zhì)粒,酶切鑒定原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)-Ag85B。 3.將上述重組成功的質(zhì)粒pET-28a(+)-Ag85B轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3),用誘導(dǎo)劑IPTG誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白rAg85B,經(jīng)SDS-PAGE分析rAg85B表達(dá)情況并通過(guò)His柱親和層析進(jìn)行純化,利用His單抗進(jìn)行Westernblot鑒定。 4.采用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒至RAW264.7細(xì)胞,于37℃,5%CO2溫箱中培養(yǎng)24-48h后,Westernblot法檢測(cè)質(zhì)粒蛋白表達(dá)情況。 5.3次肌肉注射免疫BALB/c小鼠,末次免疫2周后,ELISA法檢測(cè)血清中抗Ag85B抗體滴度。同時(shí)將小鼠脾臟淋巴細(xì)胞于Ag85B刺激下培養(yǎng),ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)液中細(xì)胞因子(IFN-γ/IL-2/IL-4/IL-10)分泌情況。 結(jié)果 1.利用特異性引物,以結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv基因組DNA和健康小鼠脾臟淋巴細(xì)胞總RNA為模板擴(kuò)增出目的基因片段,經(jīng)DNA凝膠電泳鑒定DNA條帶分別出現(xiàn)在1091bp和1608bp左右。 2.真核表達(dá)重組質(zhì)粒pcDNA3.1(-)-Ag85B、pcDNA3.1(-)-T-bet和原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)-Ag85B經(jīng)菌液PCR、雙酶切鑒定及測(cè)序驗(yàn)證后證實(shí)構(gòu)建成功。 3.轉(zhuǎn)化了pET-28a(+)-Ag85B重組質(zhì)粒的大腸桿菌BL21(DE3)在IPTG誘導(dǎo)下表達(dá)重組蛋白rAg85B,經(jīng)SDS-PAGE證實(shí)表達(dá)的rAg85B與預(yù)測(cè)的分子量大小相符,經(jīng)親和層析后獲得純化重組蛋白rAg85B。 4.將不同濃度的真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(-)-Ag85B、pcDNA3.1(-)-T-bet轉(zhuǎn)染至RAW264.7細(xì)胞,經(jīng)Western blotting證實(shí)FLAG-Ag85B和FLAG-T-bet蛋白均在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中表達(dá),在一定范圍內(nèi)與重組質(zhì)粒劑量成正相關(guān)。 5.ELISA法檢測(cè)免疫小鼠血清中抗Ag85B抗體變化情況,發(fā)現(xiàn)Vector組與T-bet組抗體滴度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而相比于Ag85B免疫組,Ag85B/T-bet組IgG2a滴度顯著增高,IgGl滴度顯著降低。 6.ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)液中特異性Thl類(lèi)(IFN-y/IL-2)和Th2類(lèi)細(xì)胞因子(IL-4/IL-10)分泌情況,發(fā)現(xiàn)T-bet組與Ag85B/T-bet組各細(xì)胞因子含量無(wú)顯著性差異。但Ag85B/T-bet組Thl類(lèi)細(xì)胞因子(IFN-γ/IL-2)水平顯著高于Ag85B組,而Th2類(lèi)細(xì)胞因子(IL-4/IL-10)水平卻顯著降低。 結(jié)論 本實(shí)驗(yàn)初步闡明T-bet基因佐劑增強(qiáng)Ag85B特異性免疫應(yīng)答作用,其抗體反應(yīng)以IgG2a為主要的抗體亞類(lèi),刺激產(chǎn)生細(xì)胞因子以Thl型為主,誘導(dǎo)顯著的Thl優(yōu)勢(shì)免疫應(yīng)答。這為進(jìn)一步研究其抗結(jié)核效應(yīng)奠定了基礎(chǔ),同時(shí)為深入理解免疫增強(qiáng)型佐劑的意義及應(yīng)用前景提供了理論基礎(chǔ)及新思路。
[Abstract]:Purpose T-bet and Ag85B eukaryotic expression plasmids were constructed. The T-bet plasmid was used as a gene adjuvant and the Ag85B plasmid molecule to construct a new type of DNA vaccine. It was reported. Methods 1. The characteristics of the full-length sequence of the target gene (Ag85B and T-bet gene) and the restriction site of pcDNA3.1 (-), pET-28a (+), and the software design of DNAClub and Premier Primer5 were designed according to the target gene (Ag85B and T-bet gene) reported in GenBank. Ag85B and T-bet genes were amplified by PCR, and the corresponding PCR products and the empty plasmid pcDNA3.1 (-) were digested with restriction enzymes, BamU 鈪，

本文編號(hào)：2491330