【摘要】： 目的: 腫瘤細胞提呈抗原給T細胞時,由于表面缺乏共刺激分子的表達,不能起始有效的抗腫瘤免疫應答。為了將共刺激分子導入腫瘤細胞以制備腫瘤疫苗,我們將表達B7-H3基因的真核表達載體pEGFP-C1-B7-H3轉(zhuǎn)染入口腔鱗癌細胞Tca8113中,檢測B7-H3基因在轉(zhuǎn)染口腔鱗癌細胞Tca8113中的表達,進一步研究轉(zhuǎn)人B7-H3基因鱗癌細胞疫苗體外誘導抗腫瘤免疫應答的能力。 方法: 采用脂質(zhì)體介導法將真核表達質(zhì)粒pEGFP-C1-B7-H3轉(zhuǎn)染入人鱗癌細胞Tca8113中,轉(zhuǎn)染24h,14d,30d后,熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白的表達,待轉(zhuǎn)染成功后,用RT-PCR檢測基因B7-H3在轉(zhuǎn)染細胞中的表達;用Western blot檢測其蛋白的表達,經(jīng)G418篩選后獲得穩(wěn)定高表達克隆。以絲裂霉素C(MMC)處理后,制成腫瘤細胞疫苗,經(jīng)體外與人外周血淋巴細胞共同培養(yǎng)后,測定淋巴細胞特異性殺傷活性及對淋巴細胞產(chǎn)生細胞因子的影響。 結(jié)果: 用Lipofectamine2000細胞轉(zhuǎn)染試劑盒把pEGFP-C1-B7-H3載體轉(zhuǎn)入口腔鱗癌細胞株Tca8113中后,于24h、14d、30d時,在10×20倍倒置顯微鏡下用熒光觀察細胞(光波波長488nm或513nm),同時與未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的口腔鱗癌細胞Tca8113做對照。轉(zhuǎn)染B7-H3的Tca8113細胞,經(jīng)過細胞傳代培養(yǎng)后仍然能夠檢測到高表達的B7-H3基因,用Trizol從轉(zhuǎn)染了pEGFP-C1-B7-H3的Tca8113細胞中提取總RNA,然后用RT-PCR檢測B7-H3的表達,PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果表明,擴增產(chǎn)物的大小約215bp,與預期的大小一致。轉(zhuǎn)染空載體pEGFP-C1的Tca8113細胞中,沒有檢測到215bp的PCR產(chǎn)物。用Western blot方法抽提B7-H3/Tca8113基因轉(zhuǎn)染細胞,裂解已轉(zhuǎn)染pEGFP-C1-B7-H3的Tca8113細胞(B7-H3/Tca8113)的基因轉(zhuǎn)染細胞膜蛋白中相對分子質(zhì)量約84～90KD大小的特異性條帶;而mock/Tca8113沒有特異性條帶。經(jīng)過G418篩選后挑取單克隆法建立了B7-H3/Tca8113細胞株。轉(zhuǎn)染B7-H3的Tca8113細胞能夠高表達B7-H3蛋白。經(jīng)MMC處理后,與野生型的Tca8113細胞相比,上述瘤苗對T細胞體外培養(yǎng)試驗顯示該基因轉(zhuǎn)染細胞與T細胞共培養(yǎng)可促進其體外增殖,誘導淋巴細胞產(chǎn)生針對Tca8113的特異性殺傷作用,能顯著增強淋巴細胞分泌IFN-γ的能力。 結(jié)論: 用脂質(zhì)體法把真核表達載體pEGFP-C1-B7-H3轉(zhuǎn)染到口腔鱗癌細胞Tca8113中,用挑選單克隆法建立了穩(wěn)定表達B7-H3蛋白的細胞株,用RT-PCR及Western blot鑒定B7-H3基因在該細胞中有表達。B7-H3/Tca8113經(jīng)MMC處理后得到TCV-hB7-H3,將其與T細胞體外培養(yǎng)試驗顯示該基因轉(zhuǎn)染細胞與T細胞共培養(yǎng)可促進其體外增殖,誘導淋巴細胞產(chǎn)生針對Tca8113的特異性殺傷作用,能顯著增強淋巴細胞分泌IFN-γ的能力。轉(zhuǎn)B7-H3基因人鱗癌細胞疫苗能誘導有效的抗鱗癌免疫反應。為以后在體內(nèi)試驗中研究B7-H3對免疫細胞的調(diào)節(jié)和腫瘤基因治療奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:Aim: when tumor cells present antigen to T cells, they can not initiate effective anti-tumor immune response due to the lack of costimulatory molecules on the surface. In order to introduce costimulatory molecules into tumor cells to prepare tumor vaccine, we transferred the eukaryotic expression vector pEGFP-C1-B7-H3 expressing B7-H3 gene into Tca8113. The expression of B7-H3 gene in oral squamous cell carcinoma cell line Tca8113 was detected, and the ability of anti-tumor immune response induced by human B7-H3 gene squamous cell carcinoma cell vaccine in vitro was further studied. Methods: the eukaryotic expression plasmid pEGFP-C1-B7-H3 was transformed into human squamous cell carcinoma cell line Tca8113 by Liposome mediated method. The expression of green fluorescent protein was observed under fluorescence microscope for 24 hours and 30 days after transfection, and after successful transfection, the expression of green fluorescent protein was observed under fluorescence microscope, and the expression of green fluorescent protein was observed under fluorescence microscope. The expression of gene B7-H3 in transfected cells was detected by RT-PCR. The expression of its protein was detected by Western blot, and the stable and high expression clone was obtained after G418 screening. The tumor cell vaccine was prepared by mitomycin C (MMC) treatment. After co-culture with human peripheral blood lymphocytes in vitro, the specific killing activity of lymphocytes and the effect on cytokines produced by lymphocytes were measured. Results: the pEGFP-C1-B7-H3 vector was transferred into oral squamous cell carcinoma cell line Tca8113 with Lipofectamine2000 cell transfer kit. At 24 h, 14 d and 30 d, the cells were observed by fluorescence under 10 脳 20 times inverted microscope (light wave wavelength 488nm or 513nm). At the same time, it was compared with oral squamous cell carcinoma cell line Tca8113, which was not infected with plasmid. The high expression of B7-H3 gene was still detected in Tca8113 cells transfected with B7-H3 after subculture. The total RNA, was extracted from Tca8113 cells transfected with pEGFP-C1-B7-H3 by Trizol, and the expression of B7-H3 was detected by RT-PCR. The results of PCR product electrophoresis showed that the size of the amplified product was about 215 BP, which was consistent with the expected size. No PCR products of 215bp were detected in Tca8113 cells transfected with empty vector pEGFP-C1. The B7-H3/Tca8113 gene transfected cells were extracted by Western blot and the specific bands of the relative molecular weight of the membrane proteins of Tca8113 cells (B7-H3/Tca8113) which had been transfected with pEGFP-C1-B7-H3 were lysed into the membrane proteins of Tca8113 cells (B7-H3/Tca8113), which were about the size of 84~90KD. However, mock/Tca8113 had no specific band. B7-H3/Tca8113 cell line was established by single clone method after G418 screening. B7-H3 protein was highly expressed in Tca8113 cells transfected with B7-H3. After MMC treatment, compared with wild type Tca8113 cells, the co-culture of T cells and T cells by the above tumor vaccine showed that the co-culture of T cells and T cells could promote the proliferation of T cells in vitro and induce lymphocytes to produce specific killing effect against Tca8113. It can significantly enhance the ability of lymphocytes to secrete IFN- 緯. Conclusion: the eukaryotic expression vector pEGFP-C1-B7-H3 was transferred into oral squamous cell carcinoma cell line Tca8113 by lipid method, and the cell line stably expressing B7-H3 protein was established by selected single clone method. The expression of B7-H3 gene in the cells was identified by RT-PCR and Western blot. TCV-hB7-H3, was obtained by MMC treatment of B7-H3/Tca8113. The culture test with T cells in vitro showed that co-culture of T cells and T cells could promote the proliferation of T cells in vitro, induce lymphocytes to produce specific killing effect against Tca8113, and significantly enhance the ability of lymphocytes to secrete IFN- 緯. Human squamous cell carcinoma cell vaccine with B7-H3 gene can induce effective anti-squamous cell carcinoma immune response. It lays a foundation for the study of the regulation of B7-H3 on immune cells and tumor gene therapy in vivo.
【學位授予單位】：安徽醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2008
【分類號】：R392;R730.5

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本文編號：2490536