【摘要】：目的： 應(yīng)用脂肪細胞和巨噬細胞條件培養(yǎng)基以及飽和脂肪酸孵育骨骼肌細胞,檢測胰島素刺激的骨骼肌葡萄糖轉(zhuǎn)運子4(GLUT4)的轉(zhuǎn)位和胰島素信號分子的磷酸化水平,研究肥胖和缺氧對骨骼肌胰島素作用的影響,探討肥胖導(dǎo)致周身胰島素抵抗的機制。 方法： 1.脂肪細胞和巨噬細胞分別進行常氧和缺氧(1%02,5%CO2,94%N2)培養(yǎng),制備條件培養(yǎng)基。 2.用脂肪細胞和巨噬細胞的條件培養(yǎng)基孵育骨骼肌細胞,采用偶聯(lián)抗體的吸光度分析法測定骨骼肌GLUT4轉(zhuǎn)位,采用(?)Vestern Blot法測定胰島素信號分子的磷酸化水平。 3.用飽和脂肪酸棕櫚酸孵育骨骼肌細胞,采用偶聯(lián)抗體的吸光度分析法測定骨骼肌中GLUT4轉(zhuǎn)位,采用(?)Vestern Blot法測定胰島素信號分子的磷酸化水平。 4.采用ELISA法測定脂肪細胞和巨噬細胞條件培養(yǎng)基內(nèi)TNF-α的水平。 5.采用Real-time PCR法,測定常氧和缺氧處理的脂肪細胞脂聯(lián)素mRNA、 TNF-a mRNA和巨噬細胞TNF-a mRNA水平。 6.采用Transwell系統(tǒng)觀察常氧和缺氧培養(yǎng)的脂肪細胞對巨噬細胞的趨化作用。 7.本研究的數(shù)據(jù)采用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。 結(jié)果： 1.缺氧處理脂肪細胞和巨噬細胞,GLUT1蛋白表達增加。 2.常氧處理的脂肪細胞條件培養(yǎng)基孵育骨骼肌細胞,在C2C12和L6兩種骨骼肌細胞中,基礎(chǔ)狀態(tài)和胰島素刺激狀態(tài)下GLUT4轉(zhuǎn)位與對照組相比無顯著性差異；缺氧處理的脂肪細胞條件培養(yǎng)基孵育骨骼肌細胞骨骼肌細胞在基礎(chǔ)狀態(tài)下GLUT4轉(zhuǎn)位與對照組相比有顯著增加(p0.05,p0.01),而胰島素刺激的GLUT4轉(zhuǎn)位與對照組相比增加無顯著性差異,C2C12骨骼肌細胞胰島素刺激GLUT4轉(zhuǎn)位增加的倍數(shù)與對照組相比呈下降趨勢,但無顯著性差異,而在L6細胞中則顯著下降(p0.05)。 3.常氧處理的巨噬細胞條件培養(yǎng)基孵育C2C12骨骼肌細胞,與對照組相比,基礎(chǔ)狀態(tài)和胰島素刺激狀態(tài)下GLUT4轉(zhuǎn)位有上升趨勢,但無顯著性差異。缺氧處理的巨噬細胞條件培養(yǎng)基孵育骨骼肌細胞,與對照組相比,基礎(chǔ)狀態(tài)下GLUT4轉(zhuǎn)位有顯著性升高(p0.05),胰島素刺激狀態(tài)下GLUT4轉(zhuǎn)位有增加趨勢,但無顯著性差異。兩組胰島素刺激GLUT4轉(zhuǎn)位增加的倍數(shù)與對照組相比均呈下降趨勢,但無顯著性差異。 4.常氧處理的脂肪細胞條件培養(yǎng)基孵育C2C12骨骼肌細胞,與對照組相比,基礎(chǔ)狀態(tài)下Akt磷酸化水平有升高的趨勢,但無顯著性差異,胰島素刺激的Akt磷酸化水平與對照組相比無顯著性差異。缺氧處理的脂肪細胞條件培養(yǎng)基孵育C2C12骨骼肌細胞,與對照組相比,基礎(chǔ)狀態(tài)下Akt磷酸化水平有升高的趨勢,但無顯著性差異,胰島素刺激的Akt磷酸化水平與對照組相比無顯著性差異。 5.常氧處理的巨噬細胞條件培養(yǎng)基孵育C2C12骨骼肌細胞,與對照組相比,基礎(chǔ)狀態(tài)下Akt磷酸化水平有升高的趨勢,但無顯著性差異,胰島素剌激的Akt磷酸化水平與對照組相比無顯著性差異。缺氧處理的巨噬細胞條件培養(yǎng)基孵育C2C12骨骼肌細胞,與對照組相比,基礎(chǔ)狀態(tài)下Akt磷酸化水平有升高趨勢,但無顯著性差異,而胰島素刺激的Akt磷酸化水平與對照組相比無顯著性差異。 6.棕櫚酸孵育骨骼肌細胞,可使骨骼肌細胞在基礎(chǔ)狀態(tài)下GLUT4轉(zhuǎn)位和對照組相比無明顯改變,而在胰島素刺激下的GLUT4轉(zhuǎn)位和對照組相比顯著降低(p0.05)。溶劑組BSA孵育的骨骼肌細胞,胰島素增加骨骼肌細胞Akt的磷酸化水平,而棕櫚酸孵育則使胰島素刺激的Akt磷酸化水平顯著性降低。胰島素增加S6K的磷酸化水平,而棕櫚酸孵育不影響胰島素刺激的S6K的磷酸化以及IRS1$636/639磷酸化水平 7.缺氧處理的脂肪細胞和巨噬細胞條件培養(yǎng)基中TNF-a水平顯著升高(p0.01)。 8.缺氧處理的脂肪細胞脂聯(lián)素mRNA水平降低(p0.01),缺氧處理的脂肪細胞和巨噬細胞TNF-α mRNA水平顯著升高(p0.01)。 9.缺氧處理的脂肪細胞吸引巨噬細胞遷移增加。 結(jié)論： 1.缺氧培養(yǎng)箱培養(yǎng)細胞,可造成脂肪細胞和巨噬細胞缺氧,模擬肥胖者脂肪組織缺氧,制備條件培養(yǎng)基。 2.常氧處理的脂肪細胞條件培養(yǎng)基孵育骨骼肌細胞可造成骨骼肌細胞胰島素刺激的GLUT4轉(zhuǎn)位增加的倍數(shù)呈下降的趨勢,但無顯著性差異。而缺氧處理的脂肪細胞條件培養(yǎng)基孵育骨骼肌細胞可造成骨骼肌細胞胰島素抵抗。 3.常氧處理和缺氧處理的巨噬細胞條件培養(yǎng)基孵育骨骼肌細胞使骨骼肌細胞胰島素刺激的GLUT4轉(zhuǎn)位增加的倍數(shù)呈下降的趨勢,但無顯著性差異。 4.飽和脂肪酸孵育可造成骨骼肌細胞胰島素抵抗,其機制可能不涉及S6K。 5.脂肪細胞在缺氧狀態(tài)下脂聯(lián)素表達水平顯著下降,TNF-α表達水平顯著增加。巨噬細胞在缺氧狀態(tài)下,TNF-α表達水平顯著增加。這些因子可能參與條件培養(yǎng)基導(dǎo)致骨骼肌胰島素抵抗的機制。 6.脂肪細胞缺氧可吸引更多的巨噬細胞,可能參與肥胖導(dǎo)致周身胰島素抵抗的機制。
[Abstract]:Purpose: The translocation of the skeletal muscle glucose transporter 4 (GLUT4) and the phosphorylation of the insulin signal molecules of the skeletal muscle glucose transporter 4 (GLUT4) in the insulin-stimulated skeletal muscle were detected using the fatty cell and the macrophage conditioned medium and the saturated fatty acid. To study the effect of obesity and hypoxia on the insulin action of skeletal muscle, and to investigate the effect of obesity on the insulin resistance of skeletal muscle. System. Methods:1. The fat cells and macrophages were cultured by normal oxygen and hypoxia (1%02,5% CO2,94% N2), respectively. Conditioned medium.2. The skeletal muscle cells were incubated with the conditioned medium of adipocytes and macrophages, and the skeletal muscle GLUT was determined using the absorbance analysis method of the coupled antibody. 4 Determination of insulin signal by using (?) western Blot method Phosphorylation level of the child.3. The skeletal muscle cells were incubated with saturated fatty acid palmitic acid, and the GL of the skeletal muscle was determined using the absorbance analysis method of the coupled antibody. U Transposition of T4, using (?) Western Blot to measure the insulin letter Phosphorylation level of the number of molecules.4. The method of ELISA was used to determine the conditions of the adipocytes and macrophages. The levels of TNF-a and TNF-a mRNA, TNF-a mRNA and macrophagocytosis in the fat cells treated with normal oxygen and hypoxia were determined by the Real-time PCR. Cell TNF-a mRNA level.6. Using the Transwell system to observe the culture of normal oxygen and hypoxia 7. The chemotaxis of fat cells to macrophages. SPS S13.1.0 Statistical analysis of the software. Results:1. Anoxia treatment Adipocytes and macrophages, GLUT1 protein expression increased.2. Normal oxygen treated fat cell conditioned medium for skeletal muscle cells, in both C2C12 and L6 skeletal muscle cells, basal and insulin Compared with the control group, the expression of GLUT4 was significantly higher than that in the control group (p0.05, p0.01) compared with the control group (p0.05, p0.01). There was no significant difference between the shock-induced GLUT4 index and the control group, and the increase of the insulin-stimulated GLUT4 index in the C2C12 skeletal muscle cells decreased in comparison with the control group, but no significant difference was observed. The difference in sex and the significant decrease in L6 cells (p0.05).3. The C2C12 skeletal muscle cells were incubated with normal oxygen-treated macrophage conditioned medium and the basal and insulin levels were compared to the control group. There was no significant difference in GLUT4 transposition in the condition of stimulation, but there was no significant difference. In the conditioned medium of the macrophages treated with hypoxia, the skeletal muscle cells were incubated, and compared with the control group, there was a significant increase in GLUT4 transposition in the basal state (p0.05), and insulin. There was an increased tendency of GLUT4 translocation in the stimulated state, but there was no significant difference. The two groups of insulin-stimulated GLUT4 translocation The increased fold decreased with the control group, but there was no significant difference.4. The cultured C2C12 skeletal muscle cells were incubated with normal oxygen treated fat cell conditioned medium, but there was no significant difference in the level of Akt phosphorylation in the basal state compared with the control group. There was no significant difference in the level of Akt phosphorylation of insulin stimulation compared with the control group. The cultured C2C12 skeletal muscle cells were incubated with hypoxic-treated fat cell conditioned medium, but there was no significant difference in Akt phosphorylation in the basal state compared with the control group. There was no significant difference in the level of Akt phosphorylation of insulin stimulation compared with that in the control group.5. The level of Akt phosphorylation in normal oxygen treated macrophage conditioned medium was higher than that of the control group, but there was no significant difference in the level of Akt phosphorylation in the basal state. There was no significant difference between the level of Akt phosphorylation and the control group, but there was no significant difference in the level of Akt phosphorylation in the basal state compared with the control group. There was no significant difference in the level of Akt phosphorylation of the insulin-stimulated cells compared with the control group.6. The skeletal muscle cells were incubated with palmitic acid, which could make the skeletal muscle cells not change significantly compared with the control group in the basal state. The GLUT4 index in the insulin-stimulated group was significantly lower than that in the control group (p0.05). The skeletal muscle cells incubated with the solvent group BSA, insulin, and the phosphoric acid of the skeletal muscle cell Akt were increased. The level of phosphorylation of the Akt phosphorylation in insulin-stimulated insulin was significantly reduced by the incubation of palmitic acid, while insulin increased the level of phosphorylation of S6K, while the incubation of palmitic acid did not affect Phosphorylation of S6K stimulated by insulin and phosphorylation of IRS1 $636/639 phosphorylation 7. Hypoxic treatment The level of TNF-a in the conditioned medium of adipocytes and macrophages increased significantly (p0.01).8. The level of adiponectin mRNA in the cultured adipocytes (p0.01) decreased (p0.01). Oxygen-treated adipocytes and macrophages, TNF-1 mRNA horizontal display Conclusion:1. Anoxia tissue culture The culture cells of the culture box can cause hypoxia of the fat cells and the macrophages, and can simulate the hypoxia of the fat tissues of the obesity patients and prepare the conditioned medium. the myoblasts can cause a downward trend in the increase in the number of GLUT4 transposition of the skeletal muscle cell insulin stimulation, However, there was no significant difference. The incubation of skeletal muscle cells with hypoxic-treated fatty cell conditioned medium could cause insulin resistance in skeletal muscle cells.3. The conditioned medium of macrophage conditioned by normal oxygen treatment and hypoxia The incubation of skeletal muscle cells resulted in a decrease in the number of GLUT4 transposition of the skeletal muscle cell insulin-stimulated 4. The incubation of saturated fatty acids can lead to insulin resistance of skeletal muscle cells, which The system may not involve S6K.5. The fat cells are fat in the oxygen-deficient state. The level of expression of adiponectin decreased significantly, and the level of TNF-VEGF was significantly increased. The levels of TNF-VEGF in the cells were significantly increased in the condition of hypoxia. These factors may be involved in the conditioned medium
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R587.1;R329

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本文編號：2488274