【摘要】： 脂肪細胞是哺乳動物的一類重要功能細胞,在維持脂類代謝及能量代謝平衡方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。前脂肪細胞分化為成熟脂肪細胞是一個復(fù)雜的過程,這一過程受到許多轉(zhuǎn)錄因子、細胞因子以及激素的調(diào)節(jié)。脂肪細胞分化與調(diào)控失�？蓪е氯祟惗喾N疾病如肥胖癥、2型糖尿病、脂肪肝、高脂血癥及乳腺癌等。前脂肪細胞的增殖和分化過程可能是研究肥胖癥發(fā)生機制的核心,同時對前脂肪細胞的增殖和分化過程的研究還可以有助于尋找減肥藥物作用的靶點。因此,在細胞和分子水平上對脂肪細胞分化調(diào)控機制研究,對探討上述重大生命和疾病過程、探索預(yù)防與治療的新途徑具有重要理論意義和應(yīng)用價值。 糖皮質(zhì)激素(glucocorticoid, GC)誘導亮氮酸拉鏈蛋白(glucocorticoid induced leucine zipper, GILZ)被報道是一種糖皮質(zhì)激素誘導蛋白,具有炎癥抑制、促護T細胞凋亡等多項作用。糖皮質(zhì)激素具有誘導細胞生長、分化和凋亡等多種功能,被認為是較好的抗炎及免疫抑制劑,已廣泛用于多種疾病的治療,如關(guān)節(jié)炎、肺氣腫、哮喘、器官抑制排斥反應(yīng)等。但重要的是長期的使用糖皮質(zhì)激素,會加速骨的丟失導致骨質(zhì)疏松,取而代之的是骨髓脂肪細胞數(shù)量的增加。報道初步顯示GILZ可能通過抑制脂肪發(fā)生而拮抗糖皮質(zhì)激素的作用,在GC作用當中起了負反饋作用。GILZ屬于亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄因子家族成員,一些研究還表明GILZ可作為一種轉(zhuǎn)錄抑制因子,與NF-KB(nuclear transcription factor kappa B, NF-κB)、轉(zhuǎn)錄因子活化蛋白-1(activator protein-1, AP-1)直接作用后參與抑制基因表達,參與了Fas/FasL、NF-κB、Ap1、Raf21等多條信號通路的信號傳遞。 在脂肪細胞形成過程中,作為細胞相關(guān)信號通路作用靶點的轉(zhuǎn)錄因子,過氧化物增殖活化受體(Peroxisome Proliferative Activated Receptor,PPARs)家族和CCAAT/增強子結(jié)合蛋白家族(CCAAT/enhance binding proteins, C/EBPs)起了重要的作用。PPARγ屬于能與靶基因調(diào)節(jié)區(qū)特異DNA反應(yīng)元件結(jié)合的核激素受體轉(zhuǎn)錄因子家族,由于啟動子和拼接方式不同,有PPARγ1、PPARγ2及PPARγ3三種亞型。PPARγ2主要表達于脂肪組織,在脂肪細胞分化的早期就表達,是對脂肪細胞分化具有決定性作用的一個異構(gòu)體。PPARγ2可以激活一系列脂肪代謝必需基因,包括脂蛋白脂酶(Lipoprotein lipase,LPL)、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(Phosphoenolpyruvate Carboxykinase, PEPCK)、脂肪酸轉(zhuǎn)運與結(jié)合蛋白(Fatty acid binding protein, FABP)、硬脂酰輔酶A去飽和酶-1(Stearoyl CoA desat urease-1, SCD-1)等,在這些基因的啟動子區(qū)都發(fā)現(xiàn)有功能性的PPAR反應(yīng)元件。另一類重要的脂肪細胞分化轉(zhuǎn)錄因子C/EBPs,它有C/EBPα, C/EBPβ和c/EBPδ等幾種異構(gòu)體,都能促進脂肪細胞分化。C/EBPα可能介導GILZ在前脂肪細胞分化中的作用,同PPARγ2可以相互激活轉(zhuǎn)錄,啟動脂肪細胞的分化。 GILZ作為一種重要的信號蛋白分子和核轉(zhuǎn)錄因子是否參與了脂肪細胞的分化,是否通過C/EBPα和PPARγ2的介導等分子機制還不十分清楚。因此,有關(guān)GILZ在脂肪細胞分化中的作用及其機制的闡明,將對預(yù)防和治療肥胖及2型糖尿病具有重要的意義。 本文共分三部分對GILZ在脂肪細胞分化中的作用及其機制作初步探討。 1)常規(guī)構(gòu)建HA-GILZ/PcDNA3重組真核表達載體、進行細胞內(nèi)表達定位；聯(lián)合3-異丁基-1-甲基-黃嘌呤(3-isobutyl-1-methyl-xanthine, MIX)、地塞米松和胰島素誘導3T3-L1前脂肪細胞,摸索建立脂肪細胞分化模型；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染3T3-L1細胞,G418篩選轉(zhuǎn)染細胞,建立HA-GILZ穩(wěn)定、高表達的3T3-L1前脂肪細胞細胞系。主要是為探討GILZ的生物學功能提供基因和細胞研究工具。 2)比較GILZ對前脂肪細胞增殖、前脂肪細胞內(nèi)的脂質(zhì)特異性著色、甘油三酯相對含量及脂肪細胞分化相關(guān)基因PPARγ2, C/EBPα, LPL和FAS的mRNA表達的影響。在細胞和基因mRNA表達水平探討GILZ的生物學作用及機制。 3)初步分析C/EBP和AP-1順式作用元件在GILZ抑制PPARγ2啟動子轉(zhuǎn)錄活性中的作用,在DNA轉(zhuǎn)錄順式作用元件分子調(diào)控水平研究GILZ的作用機制。 第一部分GILZ真核表達載體的構(gòu)建、表達定位,穩(wěn)定高表達GILZ的3T3-L1前脂肪細胞株的克隆 目的： 克隆、構(gòu)建HA標簽的糖皮質(zhì)激素誘導亮氨酸拉鏈蛋白GILZ真核表達載體,觀察其在細胞中表達與定位,建立3T3-L1前脂肪細胞分化模型及GILZ穩(wěn)定高表達株,為研究GILZ在脂肪細胞分化中的作用提供基因和細胞工具。 方法： 1.采用逆轉(zhuǎn)錄PCR (RT-PCR)法從C3H10T1/2多能干細胞中擴增GILZ cDNA編碼區(qū),并將其重組于帶有HA標簽的真核表達載體PcDNA3中。BamHⅠ/XhoⅠ雙酶切、DNA測序鑒定HA-GILZ/PcDNA3重組表達載體。 2.采用lipofectamine 2000脂質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)染HA-GILZ/PcDNA3重組表達載體至C3H10T1/2多能干細胞；采用CaCl2方法瞬時轉(zhuǎn)染HA-GILZ/PcDNA3重組表達載體至293T細胞。 3.采用HA-GILZ/PcDNA3重組表達載體通過lipofectamine 2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染3T3-L1細胞,采用G418篩選HA-GILZ穩(wěn)定表達的3T3-L1前脂肪細胞細胞系。 4.轉(zhuǎn)染48h后,采用免疫熒光檢測GILZ在C3H10T1/2多能干細胞和3T3-L1前脂肪細胞內(nèi)的表達、分布定位；采用免疫印跡法檢測GILZ在293T細胞和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HA-GILZ/PcDNA3的3T3-L1前脂肪細胞系內(nèi)的穩(wěn)定表達及分子量大小。 5.用含0.5 mmol/L 3-異丁基-1-甲基-黃嘌呤(MIX)、10μg/ml胰島素和0.25μmol/L地塞米松的脂肪細胞誘導劑(MID)誘導3T3-Ll前脂肪細胞分化,用油紅0染色法觀測脂肪細胞內(nèi)的脂質(zhì)特異性著色及測定甘油三酯相對含量。 結(jié)果： 1.HA-GILZ/PcDNA3重組表達載體經(jīng)酶切鑒定和測序分析確認構(gòu)建成功。進一步免疫熒光顯示GILZ在C3H10T1/2細胞質(zhì)和細胞核都有表達,但主要表達定位于細胞質(zhì)。免疫印跡法檢測在轉(zhuǎn)染HA-GILZ/PcDNA3重組載體的293T和3T3-Ll細胞中有一特異的分子量約20kD的蛋白條帶,獲得了高效的表達。 2.3T3-L1前脂肪細胞經(jīng)MID誘導的第3天開始,細胞內(nèi)可以觀察到反光的脂質(zhì)小滴,并隨著分化的進展越來越多的細胞出現(xiàn)脂質(zhì)小滴。到了第9天,脂肪細胞胞質(zhì)內(nèi)有大量圓形脂滴,而正常生長細胞無脂滴。油紅0染色顯示分化的3T3-L1脂肪細胞胞漿中脂滴呈桔紅色。與未含MID培養(yǎng)基對照組相比,甘油三酯相對含量顯著增加(0.139±0.022 vs 0.356±0.014,t=14.521,p=0.000)。 3.將該HA-GILZ/PcDNA3重組表達載體通過lipofectamine 2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染3T3-L1細胞后,經(jīng)G418篩選的3T3-L1細胞,免疫熒光和免疫印跡均顯示有GILZ高表達,并且跟C3H10T1/2細胞一樣,GILZ也主要表達于細胞質(zhì)。 小結(jié)： 1.成功構(gòu)建和表達HA-GILZ/PcDNA3重組表達載體,為GILZ的功能研究提供了穩(wěn)定的基因工具。 2.實驗表明GILZ主要定位表達于C3H10T1/2和3T3-Ll細胞質(zhì)中。 3.成功地誘導3T3-L1前脂肪細胞的分化,并成功建立穩(wěn)定、高表達的3T3-L1細胞克隆,為GILZ的功能研究提供了穩(wěn)定的細胞工具。 第二部分：GILZ對前脂肪細胞增殖、脂肪細胞分化及相關(guān)基因表達的影響 目的： 觀測GILZ對3T3-Ll前脂肪細胞增殖、分化的作用,研究GILZ對脂肪細胞分化相關(guān)標志基因PPARγ2, C/EBPα, LPL和FAS mRNA表達的影響,探討GILZ調(diào)節(jié)3T3-L1前脂肪細胞分化的分子機制。 方法： 1.采用MTT法,從第1天到第11天,每隔2天檢測GILZ穩(wěn)定表達3T3-L1細胞細胞的增殖情況。 2.油紅0染色觀察GILZ過表達對脂肪細胞分化和甘油三酯相對含量的影響。共分四組：1,轉(zhuǎn)染對照PcDNA3,沒有MID誘導；2,轉(zhuǎn)染HA-GILZ/PcDNA3,沒有MID誘導；3,轉(zhuǎn)染對照PcDNA3, MID誘導9天；4,轉(zhuǎn)染HA-GILZ/PcDNA3,MID誘導9天。 3.常規(guī)構(gòu)建GILZ-shRNA/pLentiLox 3.7(簡稱GILZ-shRNA)慢病毒重組載體、測序、lipofectamine 2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、293T細胞包裝、感染GILZ穩(wěn)定表達的3T3-L1細胞、實時熒光定量PCR (Real-time PCR)檢測脂肪細胞GILZ mRNA表達。 4.實時熒光定量PCR (Real-time PCR)法檢測脂肪細胞分化相關(guān)標志基因PPARγ2、C/EBPα、LPL和FAS的mRNA表達。對于GILZ過表達共分二組：轉(zhuǎn)染PcDNA3對照空載體；轉(zhuǎn)染HA-GILZ/PcDNA3重組載體；對于GILZ沉默共分二組：感染pLentiLox 3.7空載體對照；感染GILZ-shRNA/pLentiLox 3.7重組載體。 結(jié)果： 1.MTT法檢測結(jié)果,在細胞增殖的第1、3、5、7、9、11天,轉(zhuǎn)染PcDNA3空載體對照組的OD值分別是：0.090±0.008,0.154±0.004,0.273±0.017,0.471±0.008,0.609±0.013,0.610±0.018；而穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HA-GILZ的OD值分別是：0.083±0.002,0.164±0.012,0.294±0.031,0.473±0.008,0.605±0.005,0.583±0.007。與對照組相比，GILZ過表達不能顯著促進前脂肪細胞的增殖(F=2.460,P=0.068),提示GILZ對脂肪細胞的增殖沒有明顯影響。 2. GILZ-shRNA/pLentiLox 3.7測序結(jié)果與設(shè)計序列一致,將包裝的shRNA慢病毒感染至3T3-L1細胞,48h后熒光顯微鏡觀察,可見95%以上細胞呈綠色。GILZ-shRNA慢病毒感染至3T3-L1細胞48h后,在GILZ穩(wěn)定表達3T3-L1細胞內(nèi),以實時熒光定量PCR法檢測GILZmRNA表達,與pLentiLox 3.7空載體對照組相比,shRNA慢病毒基因沉默組GILZmRNA表達顯著降低(0.191±0.027 vs0.125±0.018,t=3.459,p=0.026) 3.3T3-L1細胞生長融合48h后,用脂肪細胞誘導基MID處理48h,然后換成10μg/ml胰島素的正常培養(yǎng)基(隔天換液)培養(yǎng)9天,油紅0染色顯示,與對照組相比,GILZ過表達組的桔紅色細胞大大的減少。用100%異丙醇溶解油紅0染色的細胞,500nm吸光波長測定分化9天的脂肪細胞內(nèi)甘油三酯相對含量顯著降低(0.365±0.012 vs 0.181±0.014,F=80.023,P=0.000)。以GILZ-shRNA沉默GILZ表達能減少這種抑制作用,與對照組相比,甘油三酯相對含量顯著增加(0.184±0.027 vs 0.335±0.029,F=27.189,P=0.000)。 4.MID誘導后,實時熒光定量PCR法檢測顯示,分化過程中GILZ過表達的3T3-L1細胞內(nèi)脂肪細胞分化基因PPARγ2, C/EBPα, LPL和FAS的mRNA表達顯著降低(分化第九天時分別為11.447±0.831 vs 1.173±0.290,17.700±0.915 vs1.557±0.384,67.057±5.288 vs 9.467±3.406,40.946±3.968 vs 4.967±1.091,P=0.000)；而沉默GILZ表達卻能顯著增加這些基因的表達(1.056±0.275 vs6.162±0.432,1.500±0.644 vs 9.147±0.958,8.967±1.046 vs 45.127±2.585,4.518±1.143 vs 27.974±1.634,P=0.000)。 小結(jié)： 1. GILZ對前脂肪細胞的增殖沒有明顯的影響。 2.制備的shRNA慢病毒能成功沉默GILZ的mRNA表達。 3. GILZ過表達或沉默可顯著性抑制或增加PPARγ2, C/EBPα, LPL和FAS的mRNA表達,表明GILZ可能通過下調(diào)脂肪細胞分化轉(zhuǎn)錄因子PPARγ2, C/EBPα的表達而抑制脂肪細胞特異性基因LPL和FAS的表達,進而抑制脂肪細胞的分化。 4. GILZ可抑制C/EBPα的表達。 第三部分：C/EBP和AP-1順式作用元件在GILZ抑制PPARγ2啟動子轉(zhuǎn)錄活性中的作用 目的： 通過分析C/EBP和AP-1順式作用元件在GILZ抑制PPARγ2啟動子轉(zhuǎn)錄活性的作用,探討GILZ抑制脂肪細胞的調(diào)控機制。 方法： 使用熒光素酶(Luciferase)雙報告基因系統(tǒng)檢測GILZ對PPARγ2啟動子區(qū)各順式作用元件轉(zhuǎn)錄活性的影響。 1.分別用0.1μg-615/-265-Luc報告基因(涵蓋了PPARγ2啟動子區(qū)的含C/EBP順式作用元件)、-265/-1-Luc報告基因(涵蓋了PPARγ2啟動子區(qū)的含AP-1順式作用元件),同時轉(zhuǎn)染0.01μg pRL-SV40(起校正作用報告基因)、PcDNA3(對照)與HA-GILZ/PcDNA3不同比例的質(zhì)粒于3T3-L1細胞,48h后檢測熒光素酶活性。根據(jù)PcDNA3與HA-GILZ/PcDNA3不同比例,共分四組：1,對照組,0.45μg PcDNA3；2,0.30μg PcDNA3+0.15μg HA-GILZ/PcDNA3；3,0.15μg PcDNA3+0.30μg HA-GILZ/PcDNA3；4,0.45μg HA-GILZ/PcDNA3。 2.分別用0.1μg-615/-1-Luc(含C/EBP和AP-1的PPARγ2啟動子區(qū)報告基因)、-615/-265-Luc、-265/-1-Luc,同時轉(zhuǎn)染0.01μg pRL-SV40、PcDNA3或0.45μg HA-GILZ/PcDNA3質(zhì)粒于3T3-L1細胞,48h后檢測熒光素酶活性。根據(jù)報告基因的不同,共分四組：1,對照組,0.45μg PcDNA3+0.1μg-615/-1-Luc；2, 0.45μg HA-GILZ/PcDNA3+0.1μg -615/-265-Luc；3, 0.45μg HA-GILZ/PcDNA3+0.1μg-265/-1-Luc；4,0.45μg HA-GILZ/PcDNA3+0.1μg-615/-1-Luc 結(jié)果： 1.Luciferce檢測顯示HA-GILZ可以顯著性降低含C/EBP順式作用元件的-615/-265-Luc報告基因轉(zhuǎn)錄活性(46.353±3.267 vs 22.683±1.588,F=44.394,P=0.000),隨著GILZ量的增加而抑制作用增加。 2.Luciferce檢測顯示HA-GILZ可以顯著性降低含AP-1順式作用元件的-265/-1-Luc報告基因轉(zhuǎn)錄活性(46.476±1.859 vs 29.039±1.639,F=18.293,P=0.001),隨著GILZ量的增加而抑制作用增加。 3.Luciferce檢測顯示HA-GILZ對含C/EBP順式作用元件的PPARγ2啟動子轉(zhuǎn)錄活性的抑制作用強于含AP-1順式作用元件的PPARγ2啟動子轉(zhuǎn)錄活性(22.567±1.653 vs 29.121±0.934,F=211.57,P0.05),而含C/EBP和AP-1順式作用元件的PPARγ2啟動子-615/-1-Luc轉(zhuǎn)錄活性比單獨的C/EBP或AP-1順式作用元件則更顯著性降低(14.157±0.527,P0.05)。 小結(jié)： 1.C/EBP和AP-1順式作用元件二者在GILZ對PPARγ2啟動子轉(zhuǎn)錄活性的抑制作用中都起了明顯的作用。 2. C/EBP和AP-l順式作用元件在G工LZ抑制PPARγ2啟動子轉(zhuǎn)錄作用中,C/EBP作用要強于AP-1。 3. C/EBP和AP-1順式作用元件在GILZ抑制PPARγ2啟動子轉(zhuǎn)錄作用中,具有協(xié)同作用。 結(jié)論： 三部分實驗總結(jié)如下： 1.成功構(gòu)建HA-GILZ/PcDNA3重組表達載體和建立GILZ穩(wěn)定表達的3T3-L1前脂肪細胞分化模型。 2.免疫熒光顯示GILZ在C3H10T1／2和3T3-L1細胞的細胞質(zhì)和細胞核均有表達,但主要表達于細胞質(zhì)。 3.實驗表明GILZ對前脂肪細胞的增殖沒有明顯的影響,但可抑制3T3-L1前脂肪細胞的分化。這種抑制作用的機制之一可能是GILZ通過PPARγ2啟動子上的C/EBP、AP-1元件參與抑制PPARγ2啟動子轉(zhuǎn)錄,從而進一步抑制了脂肪細胞分化相關(guān)基因PPARγ2,C/EBPα,LPL和FAS的mRNA表達。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R329

【參考文獻】

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本文編號：2485040