【摘要】： 血細(xì)胞輸注和造血干細(xì)胞(hematopoietic stem cells,HSCs)移植是目前細(xì)胞治療的常用手段,廣泛應(yīng)用于惡性血液疾病、遺傳性疾病、感染性疾病、重癥免疫缺陷及腫瘤放化療治療后的造血支持治療等領(lǐng)域。然而,血細(xì)胞來(lái)源緊張及病原微生物傳播等問(wèn)題給其臨床應(yīng)用的安全性和廣泛性帶來(lái)了很大的挑戰(zhàn)。因此,人們期望尋找更為安全、經(jīng)濟(jì)和有效的血細(xì)胞和造血干細(xì)胞的資源。 胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells,ES cells)在體外具有高度增殖和多向分化潛能,可定向誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細(xì)胞、心肌細(xì)胞、肝臟細(xì)胞、胰島β細(xì)胞、造血細(xì)胞等多種類型的細(xì)胞。ES細(xì)胞具有比成體細(xì)胞更為廣泛的分化潛能和可塑性,是最豐富的干細(xì)胞來(lái)源,備受科學(xué)家的青睞。 大量的研究表明人ES細(xì)胞在體外可定向誘導(dǎo)分化為造血細(xì)胞,有可能為臨床輸血和造血干細(xì)胞移植,及惡性血液疾病的治療提供新途徑。目前,HSCs主要來(lái)源于臍帶血、骨髓和動(dòng)員后的外周血。從臨床應(yīng)用考慮,與傳統(tǒng)來(lái)源的HSCs相比,人ES細(xì)胞來(lái)源的HSCs具有很多優(yōu)勢(shì):合適的供體骨髓的來(lái)源短缺,雖然臍帶血已建庫(kù),但臍血中的HSCs數(shù)量仍相對(duì)不足,限制了其在成人病人中的廣泛應(yīng)用。隨著干細(xì)胞及其相關(guān)技術(shù)的發(fā)展,如核移植技術(shù)以及細(xì)胞重編程技術(shù)獲得誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells, iPS細(xì)胞)等有可能為HSCs的獲得提供患者自身遺傳背景的ES細(xì)胞。此外,ES細(xì)胞在體外具有無(wú)限增殖潛能,可大量擴(kuò)增培養(yǎng),進(jìn)而生成足夠數(shù)量的HSCs,有可能成為治療各種血液疾病的新的HSCs來(lái)源。 目前,研究者主要采用可溶性細(xì)胞因子誘導(dǎo)法或造血基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)法定向誘導(dǎo)人ES細(xì)胞向造血細(xì)胞分化。盡管ES細(xì)胞向造血細(xì)胞分化的研究已經(jīng)取得了很大進(jìn)展,且其研究和應(yīng)用前景非常廣闊,但體外大規(guī)模地定向誘導(dǎo)人ES細(xì)胞分化為成熟紅細(xì)胞并最終應(yīng)用于臨床仍有很多關(guān)鍵的問(wèn)題需要解決。首先,造血發(fā)育的過(guò)程有著復(fù)雜的基因調(diào)控,目前造血細(xì)胞分化的分子調(diào)控機(jī)制尚不明確,探討ES細(xì)胞向造血細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化調(diào)控的機(jī)制也將會(huì)提高ES細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化的效率。其次,誘導(dǎo)中使用的各種細(xì)胞因子多為基因工程產(chǎn)品,價(jià)格昂貴。此外,鼠源飼養(yǎng)層是目前常用的誘導(dǎo)方法。然而,鼠源飼養(yǎng)層所帶來(lái)的異源污染極大地限制了該研究在臨床上的廣泛應(yīng)用。 本研究中,我們首先探討了前列腺素E2(prostaglandin,PGE2)在人ES細(xì)胞向造血細(xì)胞分化的作用并初步探討了其機(jī)制,在此基礎(chǔ)之上建立了轉(zhuǎn)染促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin,EPO)基因的人胎肝基質(zhì)細(xì)胞(human fetal liver stromalcells,hFLSCs),利用其條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)人ES細(xì)胞向紅系細(xì)胞分化,建立了一種新型誘導(dǎo)人ES細(xì)胞向造血細(xì)胞分化的方法,既降低了實(shí)驗(yàn)成本,又可以避免異源污染。 本研究主要包括兩部分內(nèi)容: 一、PGE2促進(jìn)人ES細(xì)胞向造血細(xì)胞分化 人ES細(xì)胞在體外可定向誘導(dǎo)分化為造血細(xì)胞,盡管目前已建立了多種不同的誘導(dǎo)體系,仍處于起步階段,細(xì)胞分化調(diào)控的機(jī)制尚不清楚,成為廣大科研工作者研究的熱點(diǎn)。 PGE2是一種重要的細(xì)胞生長(zhǎng)和調(diào)節(jié)因子。研究發(fā)現(xiàn)PGE2在正常及缺氧、感染等異常情況下對(duì)造血發(fā)育都有重要的調(diào)節(jié)作用。近年來(lái),研究表明PGE2能夠促進(jìn)造血干細(xì)胞的存活、增殖及內(nèi)環(huán)境調(diào)節(jié)方面具有一定的作用。最近研究指出PGE2能夠促進(jìn)放射性損傷后的成年斑馬魚(yú)恢復(fù)造血重建能力,提示PGE2在胚胎的造血發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。此外,PGE2也可促進(jìn)小鼠ES細(xì)胞向造血干細(xì)胞分化。因此,我們推測(cè)PGE2在人ES細(xì)胞向造血分化過(guò)程中也發(fā)揮一定作用。 我們通過(guò)與OP9基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)的方法考察PGE2對(duì)人ES細(xì)胞向造血細(xì)胞分化的影響:實(shí)驗(yàn)組添加PGE2,對(duì)照組不添加PGE2。結(jié)果發(fā)現(xiàn),100ng/ml的PGE2可抑制集落的生長(zhǎng),20ng/ml的PGE2對(duì)集落生長(zhǎng)有明顯的促進(jìn)作用,接種于半固體培養(yǎng)體系生成的造血集落最多,誘導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)胞具有向造血各譜系分化能力,加入PGE2抑制劑吲哚美辛后集落形成能力受到明顯的抑制。為了觀察PGE2對(duì)人ES細(xì)胞向造血細(xì)胞分化的影響,我們于顯微鏡下觀察共培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化,結(jié)果發(fā)現(xiàn)不添加PGE2的情況下,人ES細(xì)胞接種于OP9細(xì)胞上,部分向上皮樣細(xì)胞分化;部分形成血島樣的結(jié)構(gòu),隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)類似于血島的結(jié)構(gòu)會(huì)逐漸消失、變平。在加入PGE2的情況下,大部分會(huì)形成血島樣的結(jié)構(gòu),隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)血島樣的結(jié)構(gòu)體積變大,但形態(tài)不會(huì)發(fā)生改變。收集共培養(yǎng)3～9d的細(xì)胞,用半定量PCR檢測(cè)胚胎干細(xì)胞標(biāo)志Oct4及造血和內(nèi)皮相關(guān)基因的表達(dá)情況。結(jié)果表明,在不添加PGE2的情況下,誘導(dǎo)的細(xì)胞持續(xù)表達(dá)Oct-4,從培養(yǎng)的第3d開(kāi)始表達(dá)中胚層標(biāo)志Brachyury,早期造血標(biāo)志CD34和內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志VE-cad,從第5d開(kāi)始表達(dá)造血調(diào)控相關(guān)基因Runx1,GATA1,SCL和內(nèi)皮標(biāo)志vWF。在添加PGE2的情況下Oct-4的表達(dá)從培養(yǎng)第3d開(kāi)始降低,共培養(yǎng)的細(xì)胞從培養(yǎng)第3d開(kāi)始表達(dá)Brachyury,CD34,Runx1,GATA1,SCL和VE-cad,從培養(yǎng)第5d開(kāi)始表達(dá)vWF。這提示外源性添加PGE2可明顯促進(jìn)造血和內(nèi)皮相關(guān)基因的表達(dá)。我們進(jìn)一步考察了PGE2處理后Smad信號(hào)通路的變化。Western-blot結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,PGE2處理能夠上調(diào)p-Smad1/5的表達(dá),同時(shí)Smad4的表達(dá)也上調(diào)。而加入PGE2的抑制劑后p-Smad1/5和Smad4的表達(dá)受到抑制,提示Smad信號(hào)通路可能參與了PGE2介導(dǎo)的人ES細(xì)胞向造血細(xì)胞分化。 二、EPO基因修飾的hFLSCs條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)人ES細(xì)胞向紅系細(xì)胞分化 在ES細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化為造血細(xì)胞的過(guò)程中,研究造血微環(huán)境的調(diào)控機(jī)制是其發(fā)生和分化的重要環(huán)節(jié)。在胚胎發(fā)育的過(guò)程中,不同的造血微環(huán)境對(duì)造血的發(fā)生發(fā)揮著重要的作用。造血發(fā)生經(jīng)歷了卵黃囊造血、胎肝造血和骨髓造血三個(gè)階段。人卵黃囊造血時(shí)期發(fā)生在胚胎的4～6周;胎肝造血時(shí)期發(fā)生在胚胎的6～22周;骨髓造血時(shí)期從22周至出生以后。胎肝是造血早期發(fā)育的主要位點(diǎn),是造血細(xì)胞發(fā)育和分化的重要微環(huán)境,構(gòu)成其微環(huán)境的胎肝基質(zhì)細(xì)胞很有可能在造血細(xì)胞的發(fā)育和分化過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。此外,血細(xì)胞的產(chǎn)生還受到造血干細(xì)胞內(nèi)在基因和造血因子的共同調(diào)控,EPO是其產(chǎn)生的最重要的因子。EPO是一種糖基化的蛋白質(zhì)激素,主要來(lái)源于腎臟和肝臟,而腦、肺、脾也能產(chǎn)生少量。EPO可促進(jìn)造血干細(xì)胞向原始紅細(xì)胞分化,加速幼紅細(xì)胞的分裂、增殖,促進(jìn)血紅蛋白的合成,在紅細(xì)胞誘導(dǎo)分化研究中發(fā)揮重要作用。而造血因子提供的方式對(duì)其作用的發(fā)揮也有重要的影響。研究表明以造血生長(zhǎng)因子基因修飾的基質(zhì)細(xì)胞比相同條件下的造血生長(zhǎng)因子更能有效地調(diào)控造血。 因此,本部分研究中我們采用慢病毒系統(tǒng)建立了穩(wěn)定高表達(dá)EPO基因的hFLSCs,能夠高效分泌具有生物學(xué)活性的EPO蛋白,從而避免了添加外源性細(xì)胞因子,極大地降低了實(shí)驗(yàn)成本。隨后,將人ES細(xì)胞培養(yǎng)于低黏附的細(xì)胞培養(yǎng)皿中誘導(dǎo)生成擬胚體(embryoid bodies,EBs),用過(guò)表達(dá)EPO基因的FLSCs條件培養(yǎng)基(EPO/hFLSCs-CM)誘導(dǎo)EBs細(xì)胞向造血細(xì)胞分化,未轉(zhuǎn)染EPO基因的FLSCs條件培養(yǎng)基(hFLSCs-CM)作為陰性對(duì)照,未轉(zhuǎn)染EPO基因的FLSCs條件培養(yǎng)基外源性添加重組的EPO(hFLSCs-CM+EPO)作為陽(yáng)性對(duì)照。收集誘導(dǎo)不同天數(shù)的細(xì)胞,通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析誘導(dǎo)過(guò)程中CD34陽(yáng)性的表達(dá),以確定不同培養(yǎng)條件下EBs向造血細(xì)胞分化的情況。結(jié)果表明三種不同的培養(yǎng)體系均能誘導(dǎo)人ES細(xì)胞向造血細(xì)胞分化。然而,hFLSCs-CM組的誘導(dǎo)效率較低,在誘導(dǎo)第12d中CD34陽(yáng)性細(xì)胞低于11%。添加外源性EPO之后,人ES細(xì)胞向造血細(xì)胞定向分化的能力增強(qiáng),其中CD34+細(xì)胞最高可達(dá)13.1%。EPO/hFLSCs-CM組能更為有效地促進(jìn)人ES細(xì)胞向造血細(xì)胞分化,其中CD34+細(xì)胞可高達(dá)22.74%。此外,我們還應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)不同組細(xì)胞造血相關(guān)基因的表達(dá)情況;應(yīng)用克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了誘導(dǎo)細(xì)胞的造血集落形成能力;通過(guò)瑞氏-吉姆薩染色觀查了誘導(dǎo)細(xì)胞的形態(tài);應(yīng)用聯(lián)苯胺染色和RT-PCR方法檢測(cè)了誘導(dǎo)造血集落珠蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果表明,誘導(dǎo)生成的細(xì)胞具有造血細(xì)胞的一般特性,在半固體培養(yǎng)基中可分化為不同種類的造血集落,不同培養(yǎng)條件下產(chǎn)生的造血細(xì)胞的集落形成能力與珠蛋白的表達(dá)量不同,EPO/hFLSCs-CM誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞的造血基因的表達(dá)量及所形成的造血克隆最多,且以紅系克隆為主。此外,我們還檢測(cè)了誘導(dǎo)產(chǎn)生的紅系細(xì)胞的攜氧能力。結(jié)果顯示,EPO/hFLSCs-CM誘導(dǎo)的紅系細(xì)胞具有和臍帶血相似的“S”形氧離曲線,這表明體外誘導(dǎo)的紅系細(xì)胞具有和臍帶血相似的攜氧能力。 綜上所述,在本研究中我們初步考察了PGE2在人ES細(xì)胞向造血細(xì)胞分化過(guò)程中的作用并初步探討了其作用機(jī)制;并利用穩(wěn)定表達(dá)EPO基因的FLSCs條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)人ES細(xì)胞向紅系細(xì)胞分化,該方法可高效誘導(dǎo)人ES細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化為造血細(xì)胞,同時(shí)降低了研究成本,且有效避免了鼠源飼養(yǎng)層帶來(lái)的異源基因污染。上述研究為深入探討造血細(xì)胞的發(fā)育調(diào)控機(jī)制及以胚胎干細(xì)胞或造血干細(xì)胞為啟動(dòng)細(xì)胞大規(guī)模地誘導(dǎo)產(chǎn)生紅細(xì)胞奠定了一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R329

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