【摘要】： 血細胞輸注和造血干細胞(hematopoietic stem cells,HSCs)移植是目前細胞治療的常用手段,廣泛應(yīng)用于惡性血液疾病、遺傳性疾病、感染性疾病、重癥免疫缺陷及腫瘤放化療治療后的造血支持治療等領(lǐng)域。然而,血細胞來源緊張及病原微生物傳播等問題給其臨床應(yīng)用的安全性和廣泛性帶來了很大的挑戰(zhàn)。因此,人們期望尋找更為安全、經(jīng)濟和有效的血細胞和造血干細胞的資源。 胚胎干細胞(embryonic stem cells,ES cells)在體外具有高度增殖和多向分化潛能,可定向誘導分化為神經(jīng)細胞、心肌細胞、肝臟細胞、胰島β細胞、造血細胞等多種類型的細胞。ES細胞具有比成體細胞更為廣泛的分化潛能和可塑性,是最豐富的干細胞來源,備受科學家的青睞。 大量的研究表明人ES細胞在體外可定向誘導分化為造血細胞,有可能為臨床輸血和造血干細胞移植,及惡性血液疾病的治療提供新途徑。目前,HSCs主要來源于臍帶血、骨髓和動員后的外周血。從臨床應(yīng)用考慮,與傳統(tǒng)來源的HSCs相比,人ES細胞來源的HSCs具有很多優(yōu)勢:合適的供體骨髓的來源短缺,雖然臍帶血已建庫,但臍血中的HSCs數(shù)量仍相對不足,限制了其在成人病人中的廣泛應(yīng)用。隨著干細胞及其相關(guān)技術(shù)的發(fā)展,如核移植技術(shù)以及細胞重編程技術(shù)獲得誘導性多能干細胞(induced pluripotent stem cells, iPS細胞)等有可能為HSCs的獲得提供患者自身遺傳背景的ES細胞。此外,ES細胞在體外具有無限增殖潛能,可大量擴增培養(yǎng),進而生成足夠數(shù)量的HSCs,有可能成為治療各種血液疾病的新的HSCs來源。 目前,研究者主要采用可溶性細胞因子誘導法或造血基質(zhì)細胞共培養(yǎng)法定向誘導人ES細胞向造血細胞分化。盡管ES細胞向造血細胞分化的研究已經(jīng)取得了很大進展,且其研究和應(yīng)用前景非常廣闊,但體外大規(guī)模地定向誘導人ES細胞分化為成熟紅細胞并最終應(yīng)用于臨床仍有很多關(guān)鍵的問題需要解決。首先,造血發(fā)育的過程有著復(fù)雜的基因調(diào)控,目前造血細胞分化的分子調(diào)控機制尚不明確,探討ES細胞向造血細胞定向誘導分化調(diào)控的機制也將會提高ES細胞體外誘導分化的效率。其次,誘導中使用的各種細胞因子多為基因工程產(chǎn)品,價格昂貴。此外,鼠源飼養(yǎng)層是目前常用的誘導方法。然而,鼠源飼養(yǎng)層所帶來的異源污染極大地限制了該研究在臨床上的廣泛應(yīng)用。 本研究中,我們首先探討了前列腺素E2(prostaglandin,PGE2)在人ES細胞向造血細胞分化的作用并初步探討了其機制,在此基礎(chǔ)之上建立了轉(zhuǎn)染促紅細胞生成素(erythropoietin,EPO)基因的人胎肝基質(zhì)細胞(human fetal liver stromalcells,hFLSCs),利用其條件培養(yǎng)基誘導人ES細胞向紅系細胞分化,建立了一種新型誘導人ES細胞向造血細胞分化的方法,既降低了實驗成本,又可以避免異源污染。 本研究主要包括兩部分內(nèi)容: 一、PGE2促進人ES細胞向造血細胞分化 人ES細胞在體外可定向誘導分化為造血細胞,盡管目前已建立了多種不同的誘導體系,仍處于起步階段,細胞分化調(diào)控的機制尚不清楚,成為廣大科研工作者研究的熱點。 PGE2是一種重要的細胞生長和調(diào)節(jié)因子。研究發(fā)現(xiàn)PGE2在正常及缺氧、感染等異常情況下對造血發(fā)育都有重要的調(diào)節(jié)作用。近年來,研究表明PGE2能夠促進造血干細胞的存活、增殖及內(nèi)環(huán)境調(diào)節(jié)方面具有一定的作用。最近研究指出PGE2能夠促進放射性損傷后的成年斑馬魚恢復(fù)造血重建能力,提示PGE2在胚胎的造血發(fā)育過程中發(fā)揮重要的作用。此外,PGE2也可促進小鼠ES細胞向造血干細胞分化。因此,我們推測PGE2在人ES細胞向造血分化過程中也發(fā)揮一定作用。 我們通過與OP9基質(zhì)細胞共培養(yǎng)的方法考察PGE2對人ES細胞向造血細胞分化的影響:實驗組添加PGE2,對照組不添加PGE2。結(jié)果發(fā)現(xiàn),100ng/ml的PGE2可抑制集落的生長,20ng/ml的PGE2對集落生長有明顯的促進作用,接種于半固體培養(yǎng)體系生成的造血集落最多,誘導產(chǎn)生的細胞具有向造血各譜系分化能力,加入PGE2抑制劑吲哚美辛后集落形成能力受到明顯的抑制。為了觀察PGE2對人ES細胞向造血細胞分化的影響,我們于顯微鏡下觀察共培養(yǎng)細胞的形態(tài)學變化,結(jié)果發(fā)現(xiàn)不添加PGE2的情況下,人ES細胞接種于OP9細胞上,部分向上皮樣細胞分化;部分形成血島樣的結(jié)構(gòu),隨著培養(yǎng)時間的延長類似于血島的結(jié)構(gòu)會逐漸消失、變平。在加入PGE2的情況下,大部分會形成血島樣的結(jié)構(gòu),隨著培養(yǎng)時間的延長血島樣的結(jié)構(gòu)體積變大,但形態(tài)不會發(fā)生改變。收集共培養(yǎng)3～9d的細胞,用半定量PCR檢測胚胎干細胞標志Oct4及造血和內(nèi)皮相關(guān)基因的表達情況。結(jié)果表明,在不添加PGE2的情況下,誘導的細胞持續(xù)表達Oct-4,從培養(yǎng)的第3d開始表達中胚層標志Brachyury,早期造血標志CD34和內(nèi)皮細胞標志VE-cad,從第5d開始表達造血調(diào)控相關(guān)基因Runx1,GATA1,SCL和內(nèi)皮標志vWF。在添加PGE2的情況下Oct-4的表達從培養(yǎng)第3d開始降低,共培養(yǎng)的細胞從培養(yǎng)第3d開始表達Brachyury,CD34,Runx1,GATA1,SCL和VE-cad,從培養(yǎng)第5d開始表達vWF。這提示外源性添加PGE2可明顯促進造血和內(nèi)皮相關(guān)基因的表達。我們進一步考察了PGE2處理后Smad信號通路的變化。Western-blot結(jié)果顯示,與對照組相比,PGE2處理能夠上調(diào)p-Smad1/5的表達,同時Smad4的表達也上調(diào)。而加入PGE2的抑制劑后p-Smad1/5和Smad4的表達受到抑制,提示Smad信號通路可能參與了PGE2介導的人ES細胞向造血細胞分化。 二、EPO基因修飾的hFLSCs條件培養(yǎng)基誘導人ES細胞向紅系細胞分化 在ES細胞體外誘導分化為造血細胞的過程中,研究造血微環(huán)境的調(diào)控機制是其發(fā)生和分化的重要環(huán)節(jié)。在胚胎發(fā)育的過程中,不同的造血微環(huán)境對造血的發(fā)生發(fā)揮著重要的作用。造血發(fā)生經(jīng)歷了卵黃囊造血、胎肝造血和骨髓造血三個階段。人卵黃囊造血時期發(fā)生在胚胎的4～6周;胎肝造血時期發(fā)生在胚胎的6～22周;骨髓造血時期從22周至出生以后。胎肝是造血早期發(fā)育的主要位點,是造血細胞發(fā)育和分化的重要微環(huán)境,構(gòu)成其微環(huán)境的胎肝基質(zhì)細胞很有可能在造血細胞的發(fā)育和分化過程中發(fā)揮重要的作用。此外,血細胞的產(chǎn)生還受到造血干細胞內(nèi)在基因和造血因子的共同調(diào)控,EPO是其產(chǎn)生的最重要的因子。EPO是一種糖基化的蛋白質(zhì)激素,主要來源于腎臟和肝臟,而腦、肺、脾也能產(chǎn)生少量。EPO可促進造血干細胞向原始紅細胞分化,加速幼紅細胞的分裂、增殖,促進血紅蛋白的合成,在紅細胞誘導分化研究中發(fā)揮重要作用。而造血因子提供的方式對其作用的發(fā)揮也有重要的影響。研究表明以造血生長因子基因修飾的基質(zhì)細胞比相同條件下的造血生長因子更能有效地調(diào)控造血。 因此,本部分研究中我們采用慢病毒系統(tǒng)建立了穩(wěn)定高表達EPO基因的hFLSCs,能夠高效分泌具有生物學活性的EPO蛋白,從而避免了添加外源性細胞因子,極大地降低了實驗成本。隨后,將人ES細胞培養(yǎng)于低黏附的細胞培養(yǎng)皿中誘導生成擬胚體(embryoid bodies,EBs),用過表達EPO基因的FLSCs條件培養(yǎng)基(EPO/hFLSCs-CM)誘導EBs細胞向造血細胞分化,未轉(zhuǎn)染EPO基因的FLSCs條件培養(yǎng)基(hFLSCs-CM)作為陰性對照,未轉(zhuǎn)染EPO基因的FLSCs條件培養(yǎng)基外源性添加重組的EPO(hFLSCs-CM+EPO)作為陽性對照。收集誘導不同天數(shù)的細胞,通過流式細胞術(shù)分析誘導過程中CD34陽性的表達,以確定不同培養(yǎng)條件下EBs向造血細胞分化的情況。結(jié)果表明三種不同的培養(yǎng)體系均能誘導人ES細胞向造血細胞分化。然而,hFLSCs-CM組的誘導效率較低,在誘導第12d中CD34陽性細胞低于11%。添加外源性EPO之后,人ES細胞向造血細胞定向分化的能力增強,其中CD34+細胞最高可達13.1%。EPO/hFLSCs-CM組能更為有效地促進人ES細胞向造血細胞分化,其中CD34+細胞可高達22.74%。此外,我們還應(yīng)用實時定量PCR檢測不同組細胞造血相關(guān)基因的表達情況;應(yīng)用克隆形成實驗檢測了誘導細胞的造血集落形成能力;通過瑞氏-吉姆薩染色觀查了誘導細胞的形態(tài);應(yīng)用聯(lián)苯胺染色和RT-PCR方法檢測了誘導造血集落珠蛋白的表達情況。結(jié)果表明,誘導生成的細胞具有造血細胞的一般特性,在半固體培養(yǎng)基中可分化為不同種類的造血集落,不同培養(yǎng)條件下產(chǎn)生的造血細胞的集落形成能力與珠蛋白的表達量不同,EPO/hFLSCs-CM誘導產(chǎn)生細胞的造血基因的表達量及所形成的造血克隆最多,且以紅系克隆為主。此外,我們還檢測了誘導產(chǎn)生的紅系細胞的攜氧能力。結(jié)果顯示,EPO/hFLSCs-CM誘導的紅系細胞具有和臍帶血相似的“S”形氧離曲線,這表明體外誘導的紅系細胞具有和臍帶血相似的攜氧能力。 綜上所述,在本研究中我們初步考察了PGE2在人ES細胞向造血細胞分化過程中的作用并初步探討了其作用機制;并利用穩(wěn)定表達EPO基因的FLSCs條件培養(yǎng)基誘導人ES細胞向紅系細胞分化,該方法可高效誘導人ES細胞定向誘導分化為造血細胞,同時降低了研究成本,且有效避免了鼠源飼養(yǎng)層帶來的異源基因污染。上述研究為深入探討造血細胞的發(fā)育調(diào)控機制及以胚胎干細胞或造血干細胞為啟動細胞大規(guī)模地誘導產(chǎn)生紅細胞奠定了一定的實驗基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R329
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本文編號：2483631
