【摘要】： 目的：1.合成嵌合受體anti-erbB2 scFv-CD28-ξ的基因,并建立其真核表達(dá)載體；2.用嵌合受體anti-erbB2 scFv-CD28-ξ基因修飾NK-92細(xì)胞；3.建立荷人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB453(erbB2陽性)、MDA-MB231(erbB2陰性)裸鼠皮下移植瘤模型；4.通過體外及體內(nèi)實驗研究基因修飾的NK-92細(xì)胞對erbB2陽性乳腺癌細(xì)胞的特異性殺傷。 方法：1.設(shè)計嵌合抗原受體的基因序列,由抗erbB2抗體單鏈可變區(qū)(scFv)、c-myc tag、CD8a(ENST00000283635)、CD28(ENST00000374478)及CD3ξ鏈(ENST00000392122)連接而成,化學(xué)合成長度為50-70bp的單鏈oligo,利用PCR將合成的oligo拼接成完整的序列,將完整的序列經(jīng)HindⅢ和EcoRI酶切后連接至目的載體PCDNA3.1(+)中。2.用Amaxa Nucleofector技術(shù)將嵌合受體anti-erbB2scFv-CD28-ξ基因轉(zhuǎn)入NK-92細(xì)胞。3.RT-PCR法檢測抗原受體mRNA表達(dá)；免疫熒光法檢測抗原受體在NK-92細(xì)胞表面的表達(dá)。4.流式細(xì)胞儀檢測NK-92-scFv-erbB2-CD28-ξ和NK-92細(xì)胞表面CD27、CD158d、NKG2D和CD85j的表達(dá)變化。5.用CCK8法檢測基因修飾的NK-92細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的特異性殺傷。6.體內(nèi)抗瘤試驗：第1個模型,MDA-MB453細(xì)胞或MDA-MB231細(xì)胞接種于BALB／C裸鼠背部皮下,同時尾靜脈注射NK-92-scFv-erbB2-CD28-ξ細(xì)胞或未轉(zhuǎn)染的NK-92細(xì)胞,比較各組成瘤率。第2個模型,MDA-MB453細(xì)胞或MDA-MB231細(xì)胞接種于BALB／C裸鼠背部皮下建立裸鼠皮下移植瘤模型。荷瘤小鼠隨機(jī)分為4組,于第1、8天經(jīng)尾靜脈注射NK-92-scFv-erbB2-CD28-ξ細(xì)胞或未轉(zhuǎn)染的NK-92細(xì)胞。第2、9天分別取小鼠靜脈血用ELISA方法檢測其中γ-干擾素(IFN-γ)水平。7.實驗動物死后取出皮下移植瘤包塊和肺臟,福爾馬林固定,石蠟包埋,切片常規(guī)HE染色,免疫組化檢測CD3、NKG2D、CD56、CD16的表達(dá)。 結(jié)果：1.成功合成嵌合抗原受體基因并構(gòu)建其真核表達(dá)載體PCDNA3.1(+)-anti-erbB2 scFv-CD28-ξ。2. RT-PCR結(jié)果證實了anti-erbB2 scFv-CD28-ξmRNA在NK-92細(xì)胞中的表達(dá)；流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果提示NK-92細(xì)胞表面嵌合抗原受體anti-erbB2 scFv-CD28-ξ的表達(dá)率為18.89%。3.流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示兩種NK-92細(xì)胞表面CD27、NKG2D、CD158d、CD85j的表達(dá)沒有差異。4. anti-erbB2-NK-92細(xì)胞對erbB2陽性的MDA-MB453細(xì)胞的殺傷率較親本NK-92細(xì)胞至少提高了3倍,這種殺傷作用的增強(qiáng)是抗原特異性的,因為兩種NK-92細(xì)胞對erbB2陰性的MBA-MD231細(xì)胞的殺傷效應(yīng)沒有顯著差異。我們還證實Anti-erbB2-NK-92和親本NK-92細(xì)胞對NK細(xì)胞敏感的K562細(xì)胞的殺傷率同樣很高,說明嵌合受體的表達(dá)對NK-92細(xì)胞的固有細(xì)胞毒活性沒有影響。5.在體內(nèi)抗瘤第1種模型里,接種MDA-MB453細(xì)胞的裸鼠注射基因修飾的NK-92細(xì)胞后成瘤率(第10天)較注射親本NK-92細(xì)胞低,但接種MDA-MB231細(xì)胞的裸鼠注射這兩種NK-92細(xì)胞的成瘤率沒有明顯差異。在第2種模型里,接受anti-erbB2基因修飾NK-92細(xì)胞治療的荷MDA-MB453腫瘤小鼠的血清IFN-γ水平高于接受親本NK-92細(xì)胞治療的荷MDA-MB453腫瘤小鼠。而且,與接受親本NK-92細(xì)胞治療的荷MDA-MB453腫瘤小鼠相比,接受anti-erbB2基因修飾NK-92細(xì)胞治療的荷MDA-MB453腫瘤小鼠的腫瘤體積明顯縮小、生存期明顯延長、肺轉(zhuǎn)移發(fā)生率低、腫瘤組織中有較多淋巴樣細(xì)胞浸潤,經(jīng)免疫組化證實是NK-92細(xì)胞。 結(jié)論：1．成功合成嵌合受體anti-erbB2 scFv-CD28-ξ基因并構(gòu)建其真核表達(dá)載體；2.通過Amaxa Nucleofector技術(shù)實現(xiàn)嵌合受體anti-erbB2 scFv-CD28-ξ在NK-92細(xì)胞的高表達(dá)；3.嵌合受體anti-erbB2 scFv-CD28-ξ在NK-92細(xì)胞的表達(dá)不影響NK-92細(xì)胞的表型特征和固有抗瘤活性；4.在體外,基因修飾的NK-92細(xì)胞對erbB2陽性乳腺癌細(xì)胞有特異性殺傷；5.在體內(nèi),基因修飾的NK-92細(xì)胞可以特異性抑制erbB2陽性乳腺癌的生長
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【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R392

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2474498