【摘要】：大腸桿菌O157:H7是腸出血性大腸桿菌(Enterohemorrhagic E.coli,EHEC)中最重要的一種血清型,能產(chǎn)生志賀毒素、溶血素和黏附素導(dǎo)致出血性腸炎,腎溶血性尿毒綜合癥和血栓性血小板減少性紫癜。80年代以來,全世界出現(xiàn)過多次大規(guī)模的暴發(fā)和流行。因此,快速準(zhǔn)確的檢測(cè)方法對(duì)預(yù)防和控制大腸桿菌O157:H7的感染十分重要。 傳統(tǒng)環(huán)境微生物的研究主要是依賴于平板培養(yǎng),不僅耗時(shí)費(fèi)力,而且不能精確地反映環(huán)境菌群的存活情況。1982年徐懷恕首次提出了細(xì)菌在外界環(huán)境中存在活的非可培養(yǎng)狀態(tài)(viable but nonculturable,VBNC),微生物在環(huán)境脅迫因子的刺激下,通過一系列類似分化的遺傳程序而使自身處于一種抵抗壓力的狀態(tài),處于VBNC狀態(tài)下的細(xì)菌不能在普通平板培養(yǎng)基上生長(zhǎng)和形成菌落,在適宜的環(huán)境下,可以復(fù)蘇并恢復(fù)生長(zhǎng),并保持一定的致病力。 酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)是目前微生物檢測(cè)常用的一種方法,該方法靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便,甚至可以肉眼直接觀察顯色,在大量篩選和現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)中有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì),現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于環(huán)境監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域。間接免疫熒光法(indirect immunofluorescence,IF)也是基于抗原抗體結(jié)合的方法,其具有直觀、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn),不僅可以鑒定細(xì)菌的種類,還可以在熒光顯微鏡下觀察細(xì)菌的形態(tài)變化。 目前,這兩種方法在檢測(cè)VBNC狀態(tài)大腸桿菌的方面的研究還不夠完善,也缺乏同步對(duì)比分析。本文同時(shí)采用ELISA和IF檢測(cè)VBNC狀態(tài)的大腸桿菌O157:H7并比較各自的特點(diǎn)。 目的監(jiān)測(cè)大腸桿菌O157:H7在環(huán)境微生態(tài)漢江水與自來水中的存活情況;考察ELISA和IF檢測(cè)VBNC大腸桿菌O157:H7的可行性。 方法本實(shí)驗(yàn)將大腸桿菌O157:H7投加到模擬環(huán)境微生態(tài)的水體與自來水中,通過改變溫度和營(yíng)養(yǎng)條件,采用吖啶橙染色(acridine orange direct count,AODC)、5-氰基-2,3-二-(P-芐基-四唑氯化物)(CTC)染色(direct viable count-nucleic acid,DVC-CTC)、萘啶酮酸染色(direct viable count-nucleic acid,DVC-NA)和異養(yǎng)平板計(jì)數(shù)法(heterotrophic plate count,HPC)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)大腸桿菌O157:H7的存活情況。并同時(shí)采用ELISA和IF對(duì)處于轉(zhuǎn)變各個(gè)時(shí)期的大腸桿菌O157:H7進(jìn)行檢測(cè),對(duì)比分析兩種方法的特點(diǎn)。 結(jié)果1.在4℃、寡營(yíng)養(yǎng)條件下,3.6×10~6CFU/mL大腸桿菌O157:H7在自來水中存活10d后進(jìn)入VBNC狀態(tài),濃度為7.2×10~4CFU/mL;3.1×10~6CFU/mL大腸桿菌O157:H7在漢江水中存活58d后進(jìn)入了VBNC狀態(tài),濃度為1.2×10~5CFU/mL。2.熒光染色顯示CTC染色法檢測(cè)活菌的能力要優(yōu)于萘啶酮酸法。3.已建立的ELISA最佳工作參數(shù)為:鼠單抗?jié)舛?0μg/mL,3%BSA(10%小牛血清稀釋液)封閉,鼠抗-HRP的稀釋度1:1000,ELISA對(duì)大腸桿菌O157:H7的檢測(cè)限為104CFU/mL。已建立的IF最佳工作參數(shù)為:鼠單抗?jié)舛?效價(jià)) 1:100,羊抗鼠-FITC的濃度(稀釋倍數(shù)) 1:60,反應(yīng)時(shí)間為30min,IF對(duì)大腸桿菌O157:H7的檢測(cè)限為103CFU/mL。ELISA、IF檢測(cè)的是大腸桿菌O157:H7總菌數(shù),與HPC、活菌染色分析結(jié)合可檢測(cè)VBNC大腸桿菌O157:H7。 結(jié)論漢江水中可培養(yǎng)的大腸桿菌O157:H7存活時(shí)間比自來水中長(zhǎng),更晚進(jìn)入VBNC狀態(tài);DVC-CTC染色法更適于活菌檢測(cè);結(jié)合HPC、熒光染色分析,ELISA和IF均能檢測(cè)出VBNC狀態(tài)的大腸桿菌O157:H7。
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【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R378

【參考文獻(xiàn)】

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1 姚斐,沙莎,陳剛,紀(jì)偉尚,徐懷恕;間接酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)檢測(cè)活的非可培養(yǎng)狀態(tài)的大腸桿菌O157:H7[J];青島海洋大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2001年02期

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3 徐懷恕,黃備,祁自忠,王祥紅,紀(jì)偉尚;霍亂弧菌(Vibrio cholerae)的細(xì)胞形態(tài)研究囿——活的非可培養(yǎng)狀態(tài)細(xì)胞[J];青島海洋大學(xué)學(xué)報(bào);1997年02期

4 陳道利;馮玉華;;產(chǎn)腸毒素大腸埃希菌活的非可培養(yǎng)狀態(tài)實(shí)驗(yàn)室初步研究[J];中華流行病學(xué)雜志;2006年05期

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本文編號(hào)：2465161