【摘要】： 細(xì)菌生物膜(biofilm)是細(xì)菌黏附于非生物或生物表面后將其包裹在自身分泌的多聚物中形成的一種具有立體結(jié)構(gòu)的細(xì)胞群落,組成細(xì)菌生物膜的胞外多聚物中包括主要成分多糖和游離DNA、RNA、蛋白質(zhì)、脂類(lèi)和其他物質(zhì)。大腸桿菌(Escherichia coli)是醫(yī)院感染的重要病原菌之一,也是生物膜感染的常見(jiàn)病原菌。形成生物膜的大腸桿菌具有高度的耐藥性并能逃避免疫系統(tǒng)的攻擊,其感染易慢性化并難于控制。生物膜的耐藥機(jī)制主要包括滲透障礙、生物膜內(nèi)細(xì)菌對(duì)抗菌藥物不敏感的特殊生理狀態(tài)和部分耐藥基因的高表達(dá)。細(xì)菌形成生物膜過(guò)程中,通過(guò)群體感應(yīng)系統(tǒng)(Quorum Sensing,QS)調(diào)節(jié),細(xì)菌裂解釋放大量游離DNA,構(gòu)成細(xì)菌生物膜的骨架,維持生物膜的空間構(gòu)象。生物膜內(nèi)高濃度的細(xì)菌細(xì)胞呈緊密接觸狀態(tài),加之高濃度游離的DNA存在,為細(xì)菌生物膜內(nèi)基因的傳遞提供了有利條件。 既往以某一特定的耐藥基因?yàn)槟繕?biāo),通過(guò)對(duì)不同時(shí)間段該基因在不同菌屬間的分布,推斷不同細(xì)菌屬間可以發(fā)生基因組基因的傳遞,因發(fā)生機(jī)率較低,并無(wú)直接觀察的證據(jù)進(jìn)行說(shuō)明。迄今對(duì)細(xì)菌生物膜內(nèi)基因的傳遞多采用帶有明顯篩選特征的質(zhì)粒進(jìn)行傳遞現(xiàn)象的觀察,已有報(bào)道的細(xì)菌包括真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌(Alcaligenes eutrophus)、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、不動(dòng)桿菌(Acinetobacter sp.)和變形鏈球菌(Streptococcus mutans)等,其中真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌、銅綠假單胞菌、乳酸乳球菌可以發(fā)生接合傳遞,不動(dòng)桿菌和變形鏈球菌可以在自然條件下形成感受態(tài)而發(fā)生轉(zhuǎn)化;即使自然條件下不能形成感受態(tài)的大腸桿菌,也在生物膜形成過(guò)程中觀察到了質(zhì)粒的傳遞。與浮游細(xì)胞相比,生物膜內(nèi)質(zhì)粒的傳遞具有高效的特點(diǎn),最高可達(dá)上萬(wàn)倍。細(xì)菌生物膜內(nèi)發(fā)生的這種基因傳遞可能也是細(xì)菌獲得耐藥基因的主要途徑,并且隨著生物膜的解離,獲得耐藥基因的菌株將導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性的播散,造成更大危害。同時(shí)這些研究表明,形成生物膜是基因發(fā)生細(xì)菌間傳遞的重要保證條件,因此可以影響生物膜形成的調(diào)控因素必將對(duì)生物膜內(nèi)發(fā)生的基因傳遞具有調(diào)節(jié)作用。對(duì)其影響因素和機(jī)制的研究有助于提高對(duì)生物膜內(nèi)耐藥基因播散的認(rèn)識(shí),但目前罕有報(bào)道。 本研究以大腸桿菌為對(duì)象,針對(duì)其生物膜形成的兩個(gè)重要調(diào)節(jié)基因LuxS和pga操縱子開(kāi)展研究,它們分別編碼大腸桿菌群體感應(yīng)系統(tǒng)信號(hào)分子合成酶和生物膜中多糖主要成分β-1-6-N-乙酰-葡聚糖胺合成酶,在細(xì)菌生物膜形成過(guò)程的初始黏附和生物膜成熟過(guò)程中均具重要的調(diào)節(jié)作用。本研究收集第三軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院臨床分離的野生型大腸桿菌,對(duì)其耐藥性和形成生物膜的能力以及不同培養(yǎng)基對(duì)生物膜形成的影響因素進(jìn)行分析;研究臨床分離株和大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌形成的生物膜內(nèi)耐藥質(zhì)粒的傳遞頻率;通過(guò)熒光定量PCR分析含0.5%糖的LB培養(yǎng)基對(duì)生物膜主要調(diào)控基因luxS和pga的表達(dá)的影響;構(gòu)建大腸桿菌CAG18439群體感應(yīng)系統(tǒng)信號(hào)合成酶基因luxS敲除株,研究luxS敲除株生物膜內(nèi)耐藥質(zhì)粒傳遞的變化,并探討其機(jī)制。 研究分四部分進(jìn)行: 1.臨床分離大腸桿菌的耐藥性和生物膜形成能力的研究; 2.大腸桿菌CAG18439生物膜內(nèi)耐藥質(zhì)粒傳遞的研究; 3.含糖(0.5%)LB培養(yǎng)基對(duì)生物膜的形成和主要調(diào)控基因luxS和pga表達(dá)的影響; 4. luxS基因敲除大腸桿菌株生物膜形成及其對(duì)耐藥質(zhì)粒傳遞的影響。 材料和方法 1.材料 臨床分離大腸桿菌共127株(S1、S2、S3……S127),均分離于第三軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院2005年7月~2007年12月住院患者的臨床送檢標(biāo)本;大腸桿菌ATCC25922、DH5α(PGreenTIR-)(F-,φ80d lacZ△M15,△(lacZYA-argF)U169, deoR, recA1, endA1, hsdR17(rk-,mk+ )和MG1655為重慶西南醫(yī)院國(guó)家藥品臨床研究基地保存菌株;大腸桿菌CAG18439(F, lacZ118(Oc), lacI3042::Tn10, LAM- rph-1)由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院徐琪壽教授饋贈(zèng);DH5α(PGreenTIR+),含原核綠色熒光表達(dá)非接合型質(zhì)粒,由武漢大學(xué)病毒研究所李果博士饋贈(zèng)。 2.方法 2.1臨床分離大腸桿菌的耐藥性和生物膜形成能力的研究 2.1.1 127株臨床分離大腸桿菌對(duì)10種常用藥物的MIC測(cè)定頭孢他定、氯霉素、卡那霉素、四環(huán)素、氨曲南、頭孢哌酮、左氧沙星、氨芐西林、氨芐西林/克拉維酸和亞胺培南對(duì)臨床分離大腸桿菌的敏感性實(shí)驗(yàn),采用瓊脂倍比稀釋法; 2.1.2 127株臨床分離大腸桿菌中β-內(nèi)酰胺酶耐藥菌株攜帶常見(jiàn)β-內(nèi)酰胺酶基因的PCR檢測(cè) 根據(jù)127株大腸桿菌的藥敏結(jié)果,選擇頭孢他定和頭孢哌酮耐藥株以及在256μg/ml的濃度下氨芐西林/克拉維酸可以逆轉(zhuǎn)氨芐西林耐藥的菌株,根據(jù)以上標(biāo)準(zhǔn),篩選耐藥大腸桿菌,對(duì)TEM等7種β-內(nèi)酰胺酶基因的檢測(cè),采用PCR擴(kuò)增,瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證,選擇1個(gè)陽(yáng)性產(chǎn)物測(cè)序;臨床分離大腸桿菌β-內(nèi)酰胺酶基因的同源性分析,采用擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序在Genebank序列比對(duì)。 2.1.3 127株臨床分離大腸桿菌形成生物膜的研究 大腸桿菌在LB培養(yǎng)基中生物膜形成的檢測(cè),采用96孔板結(jié)晶紫染色法;大腸桿菌形成生物膜的能力和細(xì)菌耐藥性的相關(guān)性分析,采用非配對(duì)t檢驗(yàn); 2.2大腸桿菌CAG18439生物膜內(nèi)耐藥質(zhì)粒傳遞的研究 2.2.1大腸桿菌CAG18439攝取外源耐藥質(zhì)粒pGreenTIR的研究 pGreenTIR質(zhì)粒的提取采用堿裂解法;對(duì)檢測(cè)生物膜中細(xì)菌攝取質(zhì)粒的GFP標(biāo)記法和96孔板抗性篩選法進(jìn)行方法學(xué)探討,確定觀察方法;比較加入文獻(xiàn)報(bào)道生物膜DNA含量的等量外源性質(zhì)粒濃度時(shí),大腸桿菌ATCC25922、MG1655、臨床分離低耐藥株S17(對(duì)氨芐青霉素敏感)、DH5α和CAG18439在接種后24h對(duì)質(zhì)粒的攝取頻率。研究大腸桿菌CAG18439株接種后不同時(shí)間點(diǎn)(4h、8h、12h、16h、24h、36h和48h)以及接種后24h不同外源性質(zhì)粒濃度(0.5μg/ml、1μg/ml,2μg/ml、4μg/ml和8μg/ml)時(shí)對(duì)質(zhì)粒的攝取頻率的變化;并加入文獻(xiàn)報(bào)道生物膜DNA含量的等量外源性質(zhì)粒濃度,測(cè)定生物膜細(xì)菌和浮游菌接種后24h和48h時(shí)的質(zhì)粒攝取頻率。 2.2.2不同培養(yǎng)基對(duì)大腸桿菌CAG18439與DH5α(PGreenTIR+)共生形成生物膜過(guò)程中細(xì)菌間質(zhì)粒傳遞的研究 2.2.2.1共生培養(yǎng)耐藥質(zhì)粒最佳觀察時(shí)間的確定,以常規(guī)LB培養(yǎng)基(pH7.4)共生培養(yǎng)DH5α(PGreenTIR+)與CAG18439形成生物膜過(guò)程中耐藥質(zhì)粒的傳遞, 96孔板雙抗性篩選法檢測(cè)細(xì)菌接種后4h、8h、12h、16h、24h、36h和48h耐藥質(zhì)粒的傳遞頻率。 2.2.2.2不同培養(yǎng)基對(duì)大腸桿菌CAG18439與DH5α(PGreenTIR+)共生形成生物膜過(guò)程中細(xì)菌間質(zhì)粒傳遞的影響。以常規(guī)LB培養(yǎng)基(pH7.4)為對(duì)照,按2.2.2.1確定時(shí)間,96孔板雙抗性篩選法檢測(cè)細(xì)菌接種于不同培養(yǎng)基:含0.5%糖或100mMCaCl2的常規(guī)LB和TSB培養(yǎng)基(pH7.4)、偏酸(pH6)和偏堿(pH9)LB培養(yǎng)基共生培養(yǎng)DH5α(PGreenTIR+)與CAG18439形成生物膜過(guò)程中測(cè)定質(zhì)粒傳遞的頻率;相同條件下測(cè)定大腸桿菌生長(zhǎng)曲線。 2.3含糖(0.5%)LB培養(yǎng)基對(duì)生物膜的形成和主要調(diào)控基因luxS和pga表達(dá)的影響 2.3.1 127株臨床分離大腸桿菌生物膜形成的主要調(diào)控基因luxS和pga的PCR檢測(cè)大腸桿菌生物膜形成相關(guān)基因pga和luxS的檢測(cè),采用PCR方法擴(kuò)增,瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證。 2.3.2含糖(0.5%)LB培養(yǎng)基對(duì)大腸桿菌株生物膜的形成及其luxS和pga基因表達(dá)的影響 127株臨床分離株和4株實(shí)驗(yàn)室菌株(ATCC25922、DH5α、MG1655和CAG18439),含0.5%糖的LB培養(yǎng)基與LB培養(yǎng)基中細(xì)菌生物膜形成能力采用96孔板結(jié)晶紫染色法,采用配對(duì)t檢驗(yàn)分析;分別選擇生物膜形成增強(qiáng)和減弱最明顯的菌株,采用熒光定量PCR方法檢測(cè)pga和luxS的表達(dá)。 2.4 luxS基因敲除大腸桿菌株生物膜形成及其對(duì)耐藥質(zhì)粒傳遞的影響 2.4.1大腸桿菌CAG18439 luxS基因敲除株的構(gòu)建 pAT2-kan質(zhì)粒的構(gòu)建,PCR擴(kuò)增kan基因全序列,產(chǎn)物加A尾后連入pAT2載體;pAT2-△luxS載體的構(gòu)建,PCR分別擴(kuò)增大腸桿菌CAG18439 luxS基因上游序列和下游序列,產(chǎn)物加A尾后連入pAT2載體,測(cè)序正確后,將pAT2-kan質(zhì)粒和含上游序列pAT2質(zhì)粒分別采用BamH I和Nde I雙酶切,分別膠回收后,將上游序列連接入pAT2-kan質(zhì)粒,同樣方法將下游序列連接入已連接入上游序列的pAT2-kan質(zhì)粒;同源重組片斷的獲得,將pAT2-kan質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)細(xì)胞,增菌后提取質(zhì)粒,XhoI和BamH I雙酶切后膠回收獲得同源重組片斷;CAG18439luxS基因敲除株的獲得,采用電轉(zhuǎn)化導(dǎo)入同源重組片段的方法;大腸桿菌CAG18439luxS基因敲除的鑒定,采用PCR擴(kuò)增測(cè)序的方法。 2.4.2 luxS基因敲除大腸桿菌株生物膜形成及其對(duì)耐藥質(zhì)粒傳遞的影響大腸桿菌CAG18439△luxS接種后24h,分別96孔板結(jié)晶紫染色法和抗性篩選法對(duì)生物膜形成能力及其耐藥質(zhì)粒傳遞頻率進(jìn)行測(cè)定,生物膜內(nèi)游離DNA的定量采用乙醇沉淀法。CAG18439△luxS菌株接種后16h pgaC mRNA表達(dá),采用RT-PCR方法。 3.主要結(jié)果 3.1臨床分離大腸桿菌的耐藥性和生物膜形成能力的研究MIC測(cè)定顯示,127株臨床分離大腸桿菌除對(duì)亞胺培南100%敏感外,對(duì)氯霉素、卡那霉素、四環(huán)素、氨曲南、頭孢他定、頭孢哌酮、左氧沙星、氨芐西林、氨芐西林/克拉維酸的耐藥率分別為74.8%(95/127)、63.0%(80/127)、95.3(121/127)、48.8%(62/127)、59.8%(76/127)、40.9%(52/127)、37.8%(48/127)、74.0%(94/127)和49.6%(63/127)。57株β-內(nèi)酰胺酶耐藥株中,bla-PER、bla-TEM、bla-PSE、bla-OXA、bla-CTX、bla-SHV和bla-VEB擴(kuò)增陽(yáng)性的比例分別為0%(0/59)、85.96%(49/57)、66.67%(38/57)、14.04%(8/57)、82.46%(47/57)、22.81%(13/57)和19.30% (11/57);與PUBMED上對(duì)應(yīng)基因進(jìn)行同源性分析,進(jìn)行測(cè)序的5種(bla-TEM、bla-OXA、bla-CTX、bla-SHV和bla-VEB)β-內(nèi)酰胺酶擴(kuò)增產(chǎn)物的同源性均大于98%。 臨床分離的大腸桿菌普遍可以形成生物膜,細(xì)菌形成生物膜的能力和細(xì)菌的耐藥性沒(méi)有相關(guān)性。 3.2大腸桿菌CAG18439生物膜內(nèi)耐藥質(zhì)粒傳遞的研究 3.2.1大腸桿菌CAG18439攝取外源耐藥質(zhì)粒pGreenTIR的研究 GFP標(biāo)記法中偶然因素對(duì)質(zhì)粒攝頻率的結(jié)果影響大,所以確定以96孔板抗性篩選法進(jìn)行實(shí)驗(yàn);在質(zhì)粒濃度為2μg/ml時(shí),在接種后24h大腸桿菌菌株ATCC25922、MG1655、DH5α和CAG18439的攝取頻率分別為0.67×10-8、0.33×10-8、1.40×10-7和1.71×10-7,而S17未見(jiàn)細(xì)菌生物膜內(nèi)的質(zhì)粒攝取;大腸桿菌CAG18439接種后4h、8h、12h、16h、24h、36h和48h,耐藥質(zhì)粒的攝取頻率分別為0.22×10-7、0.36×10-7、0.68×10-7、1.22×10-7、1.57×10-7、2.03×10-7和1.93×10-7;在0.5μg/ml,1μg/ml,2μg/ml,4μg/ml和8μg/ml濃度的質(zhì)粒時(shí),接種后24h質(zhì)粒的攝取頻率分別為0.53×10-7、1.13×10-7、1.68×10-7、1.84×10-7和2.40×10-7;生物膜細(xì)菌與浮游菌在接種后24h和48h,質(zhì)粒攝取頻率分別為1.72×10-7和2.31×10-7,3.16×10-10和8.62×10-10。 3.2.2常規(guī)LB培養(yǎng)基(pH7.4)共生培養(yǎng)DH5α(PGreenTIR+)與CAG18439形成生物膜在接種后4h、8h、12h、16h、24h、36h和48h耐藥質(zhì)粒的傳遞頻率分別為0、1.78×10-8、6.89×0-8、1.13×10-7、2.07×10-7、2.37×10-7和3.10×10-7;含0.5%糖或100mM CaCl2的常規(guī)LB和TSB培養(yǎng)基(pH7.4)、偏酸(pH6)和偏堿(pH9)LB培養(yǎng)基共生培養(yǎng)DH5α(PGreenTIR+)與CAG18439形成生物膜在接種后24h質(zhì)粒的傳遞頻率分別為2.20×10-7、2.43×10-7、2.40×10-7、2.13×10-7、1.80×10-7和1.73×10-7,采用one way ANOVA統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法分析不同培養(yǎng)基與LB培養(yǎng)基(pH7.4)中質(zhì)粒傳遞的差異,p0.05,無(wú)顯著差異;生長(zhǎng)曲線測(cè)定結(jié)果顯示不同培養(yǎng)基對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)無(wú)顯著影響。 3.3含糖(0.5%)LB培養(yǎng)基對(duì)生物膜的形成及其主要調(diào)控基因luxS和pga表達(dá)的影響 3.3.1 127株細(xì)菌均含有pga和luxS基因。 3.3.2含糖(0.5%)LB培養(yǎng)基對(duì)大腸桿菌生物膜的形成及其luxS和pga基因表達(dá)的影響配對(duì)t檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)29(29/131)株生物膜形成能力顯著增強(qiáng),42(42/131)株顯著減弱;生物膜形成能力增強(qiáng)最顯著的菌株為S59,形成能力減弱最顯著的菌株為S100。S59菌株pga和luxS的表達(dá)較常規(guī)LB培養(yǎng)細(xì)菌增高;S100菌株pga的表達(dá)降低,但luxS表達(dá)增高。 3.4 luxS基因敲除大腸桿菌株生物膜形成及其對(duì)耐藥質(zhì)粒傳遞的影響 3.4.1大腸桿菌CAG18439luxS基因敲除株的構(gòu)建PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序證明成功構(gòu)建luxS基因敲除株。 3.4.2 luxS基因敲除大腸桿菌株生物膜形成及其對(duì)耐藥質(zhì)粒傳遞的影響接種后24h的研究發(fā)現(xiàn),大腸桿菌CAG18439△l uxS生物膜形成能力下降,生物膜內(nèi)游離DNA含量減少,質(zhì)粒的傳遞頻率下降。接種后16h pgaC mRNA表達(dá)水平降低。 4.全文結(jié)論 4.1臨床分離大腸桿菌的耐藥率較高,并存在一株細(xì)菌攜帶多個(gè)β-內(nèi)酰胺酶耐基因,一種β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因分布于多個(gè)細(xì)菌的情況,在正常培養(yǎng)條件下幾乎全部的菌株都可以形成生物膜,但其形成生物膜的能力有較大差異,菌株的耐藥性與生物膜形成能力之間沒(méi)有顯著差異。 4.2細(xì)菌生物膜內(nèi)耐藥質(zhì)粒的傳遞存在菌株特異性,在生物膜初始形成時(shí)發(fā)生的頻率最高,且這種轉(zhuǎn)化頻率隨質(zhì)粒濃度的增加而增高,但無(wú)線性關(guān)系;不同培養(yǎng)基和鈣離子的存在對(duì)生物膜內(nèi)耐藥質(zhì)粒的傳遞影響不明顯,表明這種耐藥質(zhì)粒的傳遞機(jī)制是完全不同于常規(guī)的轉(zhuǎn)化途徑。 4.3 127株大腸桿菌均存在pgaA、pgaB、pgaC、pgaD和luxS基因,提示pga和luxS基因具有較高的保守性;含0.5%的糖的LB培養(yǎng)基對(duì)不同菌株可以表現(xiàn)為對(duì)細(xì)菌生物膜形成能力的增強(qiáng)和減弱,細(xì)菌pga基因的表達(dá)與其作用相一致;但無(wú)論是在生物膜形成能力增強(qiáng)還是在生物膜形成能力減弱的菌株,luxS基因的表達(dá)均表現(xiàn)為上調(diào),表明luxS作為生物膜形成的上游調(diào)控基因,對(duì)外界環(huán)境的變化反應(yīng)靈敏,而pga只是生物膜調(diào)控的效應(yīng)基因,其表達(dá)強(qiáng)弱與生物膜的形成強(qiáng)弱一致。在pga基因固有表達(dá)就低的菌株,即使環(huán)境因素導(dǎo)致luxS基因表達(dá)上調(diào),生物膜的形成仍不會(huì)增強(qiáng)。 4.4大腸桿菌CAG18439luxS基因缺失株生物膜形成能力下降,生物膜內(nèi)耐藥質(zhì)粒的傳遞頻率降低,其機(jī)制可能是luxS突變導(dǎo)致pga的表達(dá)下調(diào),生物膜形成能力下降,同時(shí)細(xì)菌裂解釋放游離的DNA減少所導(dǎo)致。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類(lèi)號(hào)】：R378

【引證文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2464927