【摘要】： 目的優(yōu)化出生后1-3d小鼠神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)分離和無血清培養(yǎng)方法,觀察其生長、增殖和分化特點(diǎn)。 方法采用無血清培養(yǎng)技術(shù),以Neurobasal+B27培養(yǎng)液和DMEM/F12+N2培養(yǎng)液為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,添加堿性成纖維細(xì)胞生長因子、血小板生長因子,分離出生后1-3d的小鼠海馬、室管膜下區(qū)進(jìn)行體外擴(kuò)增培養(yǎng)、傳代觀察,計(jì)算克隆形成率,比較兩種培養(yǎng)基對干細(xì)胞增殖的影響。去除絲裂原刺激并加入1%FBS對神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)分化,以免疫細(xì)胞化學(xué)方法對神經(jīng)干細(xì)胞以及其分化后的細(xì)胞進(jìn)行鑒定并觀察誘導(dǎo)不同時(shí)間后的分化特點(diǎn)。 結(jié)果分離獲取的細(xì)胞具有自我更新和增殖能力,原代及傳代培養(yǎng)均可形成細(xì)胞克隆,克隆中的細(xì)胞巢蛋白(Nestin)表達(dá)陽性,顯微鏡下觀察見典型的干細(xì)胞特征,誘導(dǎo)分化后的細(xì)胞經(jīng)免疫熒光檢測GFAP(星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物)和TUJI(神經(jīng)元標(biāo)志物)表達(dá)均為陽性。且在去除絲裂原加入1%FBS后,觀察到GFAP和TUJI雙標(biāo)陽性的細(xì)胞,且百分率隨時(shí)間的延長,逐漸減少(分化7天的百分率為77.33±3.79%,分化14天的百分率降為23.67±4.16%,分化20天的百分率進(jìn)一步降為14.67±3.06%,(P0.01))。 結(jié)論采用無血清培養(yǎng)技術(shù)可獲得大量的神經(jīng)干細(xì)胞,分離培養(yǎng)的細(xì)胞為具有自我更新和增殖能力的NSCs,可誘導(dǎo)分化為終末神經(jīng)細(xì)胞,且分化具有時(shí)空性。 目的：觀察Cyclin D1基因敲除其對小鼠神經(jīng)干細(xì)胞(NSC)細(xì)胞周期和凋亡的影響。 方法：選用Cyclin D1基因敲除小鼠,采用無血清培養(yǎng)技術(shù)離體培養(yǎng)干細(xì)胞增殖,流式細(xì)胞術(shù)觀察Cyclin D1基因敲除對神經(jīng)干細(xì)胞細(xì)胞周期的影響,并通過TUNEL方法檢測神經(jīng)干細(xì)胞凋亡的百分率并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 結(jié)果：Cyclin D1基因敲除使神經(jīng)干細(xì)胞細(xì)胞周期更多的阻滯于G0/G1期,經(jīng)TUNEL檢測凋亡發(fā)現(xiàn)cyclinD1敲除后,CyclinD1+/+組為18.00±3.61,而CyclinD1-/-組為55.00±6.24,其神經(jīng)干細(xì)胞凋亡的百分率明顯升高(P0.01)。 結(jié)論：通過Cyclin D1基因敲除,使神經(jīng)干細(xì)胞細(xì)胞周期更多的阻滯于G0/G1期,并誘導(dǎo)其凋亡。 目的：采用cyclin D1基因敲除小鼠,觀察細(xì)胞周期調(diào)控對小鼠神經(jīng)干細(xì)胞(NSC)分化的影響。 方法：選用cyclin D1基因敲除小鼠,采用無血清培養(yǎng)技術(shù)離體培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞,在1%FBS+LIF+BMP-2的作用下誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞向星形膠質(zhì)細(xì)胞分化,在RA和Forskolin的作用下誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞分化為神經(jīng)元,采用免疫熒光的方法觀察cyclin D1基因敲除對神經(jīng)干細(xì)胞分化為星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元的影響并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 結(jié)果：經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,cyclin D1敲除后,GFAP的陽性率明顯降低(P0.01),TUJI的陽性率沒有明顯改變,cyclin D1基因敲除顯著減少了神經(jīng)干細(xì)胞向星形膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞分化,而對神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化沒有顯著影響。 結(jié)論：通過cyclin D1基因敲除,顯著抑制了神經(jīng)干細(xì)胞向星形膠質(zhì)細(xì)胞分化。 目的：采用cyclin D1基因敲除小鼠,觀察細(xì)胞周期調(diào)控對在體小鼠神經(jīng)干細(xì)胞(NSC)增殖的影響。 方法：選用cyclin D1基因敲除小鼠,分為Cyclin D1+／+,Cyclin D1+/．和Cyclin D1-/三組,采用腹腔注射BrdU(50mg／kg),7d后取材,進(jìn)行冰凍切片,免疫熒光觀察BrdU的陽性率,觀察cyclin D1基因敲除對神經(jīng)干細(xì)胞增殖的影響并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 結(jié)果：經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,cyclinD1敲除后,和cyclinD1+／+ and CyclinD1+／-組相比,SVZ區(qū)的DG和SVZ區(qū)BrdU的陽性率明顯降低(DG區(qū)cyclinD 1-／-為16.67±1.76% cyclinD1+／+為33.00±1.16%,(P0.01),SVZ區(qū)cyclin D1基因敲除BrdU的陽性率顯示了更明顯的下降,cyclinD1-/-為31.67±2.03,wild type為92.00±4.36, (P0.01)。 結(jié)論：通過cyclin D1基因敲除,顯著抑制了在體DG和SVZ區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R329

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本文編號(hào)：2463840