【摘要】： 目的: T細胞免疫球蛋白域粘蛋白域蛋白(T cell immunoglobulin domain andmuein domain protein,Tim)家族是與疾病相關(guān)的一個新基因家族。Tim-4是Tim家族成員之一,小鼠Tim-4僅選擇性表達于抗原提呈細胞----巨噬細胞和樹突狀細胞表面。本研究的主要目的是探討Tim-4對小鼠巨噬細胞生物學活性的影響,為調(diào)節(jié)巨噬細胞功能活性的研究提供新的思路,為新型免疫分子Tim-4的相關(guān)研究提供新的理論學說,為干預巨噬細胞參與的相關(guān)疾病提供新的靶點。 方法: 1.Tim-4在小鼠巨噬細胞中的表達及阻斷Tim-4對小鼠巨噬細胞系RAW264.7生物學活性的影響 將小鼠巨噬細胞系RAW264.7接種于24孔培養(yǎng)板,24 h后加入LPS刺激,終濃度分別為10 ng/mL、50 ng/mL及100 ng/mL,同時設PBS對照組。48h后收集細胞,RT-PCR檢測Tim-4 mRNA表達,流式細胞術(shù)檢測Tim-4蛋白表達。 將小鼠巨噬細胞系RAW264.7接種96孔培養(yǎng)板,24 h后其中兩組分別加入羊IgG(終濃度為5μg/mL)、羊抗小鼠Tim-4抗體(終濃度為5μg/mL),37℃孵育1 h,再分別加入LPS(終濃度為1 00 ng/mL)。另外兩組分別加入PBS和LPS(終濃度為100 ng/mL),48 h后收集細胞培養(yǎng)上清,Griess法檢測NO的分泌,RT-PCR檢測誘生型一氧化氮合酶(indueible Nitric OXide Synthase,iNOS)mRNA的表達。 2.穩(wěn)定高表達Tim-4巨噬細胞系的建立及鑒定 設計Tim-4特異性引物,包含HindⅢ和BamHⅠ酶切位點,以小鼠腹腔巨噬細胞cDNA為模板,RT-PCR擴增小鼠Tim-4全基因片段,凝膠電泳,觀察分析結(jié)果。PCR產(chǎn)物經(jīng)HindⅢ和BamHⅠ雙酶切,回收克隆入pcDNA3.0載體,進行連接、轉(zhuǎn)化,LA平板篩選陽性克隆pcDNA3.0-Tim-4。PCR、酶切及DNA測序分析鑒定其正確性。利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒將重組子轉(zhuǎn)染小鼠巨噬細胞系RAW264.7,經(jīng)G418篩選,建立穩(wěn)定高表達Tim-4的小鼠巨噬細胞系RAW264.7-T4,經(jīng)RT-PCR、流式細胞術(shù)和免疫細胞化學染色的方法檢測Tim-4 mRNA和蛋白的表達水平。 3.Tim-4基因過表達對小鼠巨噬細胞系RAW264.7生物學活性的影響 利用建立的穩(wěn)定高表達小鼠Tim-4的巨噬細胞系RAW264.7-T4,以穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pcDNA3.0的細胞系RAW264.7-P為對照組,接種于96孔培養(yǎng)板,各組設LPS刺激組(終濃度為100 ng/mL)與PBS對照組,LPS刺激24 h后收集培養(yǎng)上清,Griess法檢測NO的分泌,抽提各組細胞總RNA,RT-PCR分析各組細胞iNOS及TNF-αmRNA的表達。 收集RAW264.7-P、RAW264.7-T4兩組細胞,流式細胞術(shù)檢測細胞表面分子MHC-Ⅱ類分子、CD80、CD86的表達及對FITC-右旋糖酐(FITC-dextran)的吞噬能力。 結(jié)果 1.Tim-4在小鼠巨噬細胞中的表達及阻斷Tim-4對小鼠巨噬細胞系RAW264.7生物學活性的影響 利用RT-PCR的方法檢測Tim-4 mRNA的表達,結(jié)果顯示巨噬細胞RAW264.7僅表達較低水平的Tim-4,而100 ng/mL LPS刺激后Tim-4的表達明顯升高。流式細胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)經(jīng)LPS刺激后,Tim-4蛋白的表達呈現(xiàn)上升趨勢,并呈劑量依賴性。 分別收集PBS對照組、LPS刺激組、羊IgG加LPS刺激組及Tim-4抗體加LPS刺激組的細胞培養(yǎng)上清,檢測NO的分泌,結(jié)果顯示Tim-4抗體加LPS刺激組NO的分泌顯著高于IgG對照組(50.4±4.49μmol/L;35.44±5.12μmol/L,P＜0.05),抽提各組細胞總RNA,RT-PCR檢測結(jié)果顯示,Tim-4抗體加LPS刺激組iNOSmRNA表達水平亦顯著高于對照組(1.56±0.05;1.17±0.07,P＜0.05)。 2.穩(wěn)定高表達Tim-4巨噬細胞系的建立及鑒定 將成功構(gòu)建的pcDNA3.0-Tim-4真核表達載體及對照載體pcDNA3.0分別轉(zhuǎn)染入RAW264.7細胞,經(jīng)G418篩選,RT-PCR和流式細胞術(shù)、免疫細胞化學染色分析發(fā)現(xiàn)RAW264.7-T4細胞其Tim-4在mRNA和蛋白質(zhì)水平上都有較高表達,表明成功建立了穩(wěn)定高表達小鼠Tim-4的巨噬細胞系(將建立的細胞系分別命名為RAW264.7-74 RAW264.7-P)。 3.Tim-4過表達對小鼠巨噬細胞系RAW264.7生物學活性的影響 利用建立的穩(wěn)定高表達小鼠Tim-4的巨噬細胞模型,以pcDNA3.0轉(zhuǎn)染RAW264.7并篩選成功的細胞(RAW264.7-P)為對照組,發(fā)現(xiàn)RAW264.7-T4細胞LPS(終濃度100 ng/mL)刺激與未刺激時其NO分泌及iNOS、TNF-αmRNA表達均顯著低于RAW264.7-P組(P＜0.05)。 高表達小鼠Tim-4的巨噬細胞組其表面分子CD80的表達百分率低于空載體組(26.12±0.84:80.5±1.96),CD86分子的表達百分率亦低于空載體組(3.63±1.75:1.4±1.05),差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);而兩組細胞MHC-Ⅱ類分子的表達及對FITC-dextran的吞噬能力均無顯著性差異(P＞0.05)。 結(jié)論: 小鼠巨噬細胞RAW264.7表達內(nèi)源性Tim-4,經(jīng)絲裂原LPS刺激后,Tim-4mRNA及蛋白水平上調(diào),并呈劑量依賴性:Tim-4通過影響NO分泌、iNOS、TNF-αmRNA的表達及共刺激分子CD80、CD86的表達負性調(diào)節(jié)小鼠巨噬細胞RAW264.7的生物學活性。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2008
【分類號】：R392

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本文編號：2460507