【摘要】： 群勃龍化學(xué)名為去甲雄三烯醇酮(17-β-hydroxyestra-4,9,11-trien-3-one-17-acetate),是人工合成的甾類男性激素,也是家畜的生長促進劑,人服用這類肉制品同樣會給身體健康帶來危害。此外,群勃龍也成為體育比賽興奮劑的一個可能來源。歐盟禁止進口使用該類產(chǎn)品的食品,也是我國海關(guān)禁止檢出的31種獸藥之一。目前,群勃龍在食品中殘留量的檢測主要依賴于質(zhì)譜技術(shù),如氣相色譜-質(zhì)譜技術(shù)(GC-MS)、液相色譜-質(zhì)譜技術(shù)(LC-MS)等。隨著單克隆抗體技術(shù)、分子生物學(xué)及現(xiàn)代免疫測定技術(shù)的發(fā)展,建立方便于基層檢驗檢疫部門應(yīng)用的快速、靈敏的群勃龍檢測方法,對從源頭上監(jiān)測、控制此類物質(zhì)的擴散具有重要意義。群勃龍是小分子化合物,需要與大分子載體(蛋白質(zhì))偶聯(lián)后才具有免疫原性。本研究采用琥珀酸酐對群勃龍進行化學(xué)修飾,并將獲得的群勃龍-半琥珀酸酯(TR-HS)與BSA偶聯(lián)以賦予其免疫原性,經(jīng)注射家兔分析免疫效果和建立ELISA監(jiān)測方法。 目的： 群勃龍(Trenbolone, TR)化學(xué)名為去甲雄三烯醇酮(17-β-hydroxyestra-4,9,11-trien-3-one-17-acetate),TR是一小分子半抗原物質(zhì),為了賦予其免疫原性,對其化學(xué)結(jié)構(gòu)作適當(dāng)修飾并與牛血清白蛋白(BSA)偶聯(lián),以期獲得群勃龍完全抗原,繼而制備群勃龍?zhí)禺愋钥贵w和建立群勃龍?zhí)禺愋詸z測方法。 方法： (1)利用紅外光譜、質(zhì)譜分析、核磁共振對所購群勃龍原料結(jié)構(gòu)進行鑒定。 (2)結(jié)構(gòu)的修飾：將群勃龍和琥珀酸酐,以吡啶溶解,80°C攪拌反應(yīng)3h。反應(yīng)液冷卻至室溫,調(diào)整其pH為3.0,得棕黃色粘稠物,過夜后變硬。用熱的異丙醇重結(jié)晶提純,紅外燈烘干即為TR-半琥珀酸酯(TR-HS),采用質(zhì)譜法對其分子量進行預(yù)測,利用紅外光譜核磁共振對其鑒定。 (3) TR-HS與BSA偶聯(lián)物的制備：采用混合酸酐法和碳化二亞胺法(EDC),將TR-HS與BSA偶聯(lián)制備成偶聯(lián)物。 混合酸酐法：TR-HS與BSA按摩爾比100：1反應(yīng)：取TR-HS 5.5 mg溶于2mL的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中,置4℃冰箱中預(yù)冷10 min,于冰浴磁力攪拌,加入三丁胺30μL,再加入氯甲酸異丁酯151μL,然后將該溶液置4℃冰箱中反應(yīng)1h即為反應(yīng)液Ⅰ液；取10.0mg BSA溶于2mL蒸餾水,溶解后于冰浴邊攪拌邊用1 mol/L NaOH調(diào)pH為8.5制得Ⅱ液；邊攪拌邊將Ⅰ液緩慢滴加到Ⅱ液中,于4℃攪拌反應(yīng)過夜。反應(yīng)產(chǎn)物充分透析,即得TR-BSA偶聯(lián)物溶液,將其冷凍干燥保存?zhèn)溆谩?碳二亞胺法(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide,EDC)法：TR-HS與BSA按摩爾比100：1反應(yīng)。取TR-HS. NHS, EDC按摩爾比1：1：l溶于1ml DMF,混勻后于4℃下活化1h,此為反應(yīng)液Ⅰ液；取10mg BSA溶于3mL雙蒸水中,加DMF0.5～1.0ml混勻,4℃預(yù)冷20min,得Ⅱ液；邊攪拌邊將Ⅰ液緩慢滴加到Ⅱ液中,于4℃攪拌反應(yīng)過夜。反應(yīng)產(chǎn)物充分透析,即得TR-BSA偶聯(lián)物,冷凍干燥保存。 (4)包被抗原：OVA與TR-HS偶聯(lián)所得,方法同BSA與TR-HS偶聯(lián)中的混合酸酐法。 (5)采用MALDI-TOF.紫外光譜法分析偶聯(lián)結(jié)果。 (6) TR-BSA免疫家兔制備抗血清將制備的TR-BSA用完全福氏佐劑常規(guī)法免疫家兔,用TR-BSA與不完全福氏佐劑乳化后加強免疫。獲得的免疫血清用ELISA間接法和雙向免疫擴散,測定特異性抗血清效價,分析其免疫原性和判斷免疫效果。 結(jié)果： (1)本研究所采用TR原料經(jīng)鑒定紅外特征峰與理論相符,核磁共振氫譜、碳譜各根值與理論一致。 (2)群勃龍化學(xué)修飾物鑒定 KBr壓片紅外測試,2974 cm-1為羧基上的O-H不對稱伸縮振動峰,1738 cm-1為骨架六元環(huán)上C=O不對稱伸縮振動峰。氣相質(zhì)譜顯示的基峰,MS(EI):m/z= 270,此峰為化合峰碎裂形成的最強峰。'H NMR (400 MHz, CDC13, rt):δ= 0.96 (s,3H, CH_3),1.32 (m,1H, CH2), 1.54 (m,3H, CH_2),1.61 (m,1H,CH_1),1.93 (d,1H, J= 12.4, CH2),2.27 (m,1H,CH_1),2.44-2.60(m,5H, CH2),2.69-2.72 (m,4H, CH2),2.86 (m, 2H, CH2),4.84 (t,1H, J= 7.6,OCH),5.81 (s,1H, CH),6.36 (d,1H, J= 9.6, CH),6.44 (d,1H, J= 10.0, CH),經(jīng)過1H NMR、13CNMR、NMR二維圖、IR、MS確認其結(jié)構(gòu)。 (3)用PRF-S02(ultraflexTOF/TOF)儀器檢測BSA、混合酸酐法制備的TR-BSA,兩者的相對分子量分別為Mr.6,7146和Mr.7,4471。由此估算偶聯(lián)比率為20.8。 (4)紫外／可見分光光度計對BSA、TR-HS、TR-BSA進行掃描測定顯示,混合酸酐法、EDC法所得偶聯(lián)物峰形發(fā)生明顯變化,278nm吸收峰明顯降低,且在343nm處吸收值明顯增大,說明偶聯(lián)是成功的。以20%乙醇為溶劑并以之調(diào)零,紫外光度法估算偶聯(lián)比率,混合酸酐法結(jié)合比約為1：18；EDC法結(jié)合比約為l：12。 (5) TR-BSA免疫的家兔血清,經(jīng)ELISA測得TR特異性抗體效價為1：320000；雙向免疫擴散測得的抗血清效價為1：16。 結(jié)論： (1)成功合成了TR-半琥珀酸酯(TR-HS)。 (2)成功制備了具有明顯免疫原性的TR-BSA偶聯(lián)物,為群勃龍單克隆抗體的制備和建立食品中群勃龍殘留量的快速檢測方法奠定了基礎(chǔ)。 (3) TR-BSA經(jīng)免疫家兔獲得了較高效價的抗血清,表明此偶聯(lián)物具有良好的免疫原性,為開展針對TR半抗原的免疫檢測和TR污染監(jiān)測奠定了基礎(chǔ)。
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【學(xué)位授予單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R392.11

【引證文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 馮才偉;何方洋;周德剛;聶雯瑩;;動物源性食品中群勃龍ELISA檢測技術(shù)的研究與應(yīng)用[J];畜牧與飼料科學(xué);2011年01期

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本文編號：2457795