【摘要】： 背景與目的: 肺炎鏈球菌是引起社區(qū)獲得性肺炎、中耳炎、菌血癥及兒童腦膜炎的主要致病菌,發(fā)展中國家每年有超過500萬例的5歲以下兒童死于肺炎鏈球菌感染。目前控制肺炎鏈球菌感染的手段是抗生素治療,但是日趨嚴(yán)重的肺炎鏈球菌耐藥問題已成為全球公共衛(wèi)生領(lǐng)域的重大難題,亦危及肺炎鏈球菌的治療效果。應(yīng)用疫苗防治肺炎鏈球菌感染是目前WHO提出減少耐藥菌傳播、緩解抗生素耐藥壓力,保護(hù)高危人群的唯一方法。 目前應(yīng)用的傳統(tǒng)肺炎鏈球菌疫苗(23價(jià)莢膜多糖疫苗和7價(jià)蛋白-多糖結(jié)合疫苗)存在血清型依賴、針對(duì)高危人群保護(hù)不足、價(jià)格高昂等諸多不足,研究新一代肺炎鏈球菌DNA和蛋白疫苗因其廣覆蓋、高效能、低成本的優(yōu)勢(shì)在發(fā)展中國家具有深遠(yuǎn)的社會(huì)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)效益。 選擇廣泛覆蓋、高度保守、具備強(qiáng)免疫原性的靶抗原是研究基因疫苗的首要問題。肺炎鏈球菌的眾多毒力蛋白在肺炎鏈球菌感染的不同階段發(fā)揮不同的毒力作用,雖然在眾多國內(nèi)外研究中發(fā)現(xiàn)了許多對(duì)肺炎鏈球菌感染具有一定保護(hù)性作用的毒力蛋白,但到目前為止尚無一種蛋白被認(rèn)為具有激發(fā)機(jī)體針對(duì)所有致病肺炎鏈球菌菌株攜帶、定殖、遷移及黏附侵襲全過程的免疫保護(hù)效能。因此,評(píng)估具有協(xié)同激發(fā)機(jī)體保護(hù)性免疫的優(yōu)勢(shì)抗原組合及針對(duì)優(yōu)勢(shì)抗原組分的進(jìn)一步探索研究具有重要意義。 本課題圍繞“肺炎鏈球菌毒力相關(guān)蛋白基因工程疫苗優(yōu)勢(shì)抗原篩選”進(jìn)行了以下研究工作:⑴采集肺炎鏈球菌感染的社區(qū)獲得性肺炎患者血清,分析其恢復(fù)期血清特異性抗體水平升高情況,評(píng)價(jià)肺炎鏈球菌表面蛋白A(pneumococcal surface protein A, PspA)、肺炎鏈球菌黏附素A(pneumococcal surface adhesion A ,PsaA)及肺炎鏈球菌溶血素(pneumolysin,Ply)三種毒力蛋白在肺炎鏈球菌經(jīng)自然途徑感染人體過程中的免疫原性;⑵復(fù)制肺炎鏈球菌鼻咽部定植及腹腔感染動(dòng)物模型,檢測(cè)三種毒力蛋白單獨(dú)或聯(lián)合形式的免疫原性差異及對(duì)肺炎鏈球菌攜帶及侵襲性感染的免疫保護(hù)效能差異,篩選肺炎鏈球菌新一代疫苗的優(yōu)勢(shì)靶抗原組合形式;⑶進(jìn)一步利用分子遺傳學(xué)及免疫學(xué)技術(shù)針對(duì)篩選出的優(yōu)勢(shì)抗原蛋白進(jìn)行分子進(jìn)化及比較基因組學(xué)的初步研究。旨在為肺炎鏈球菌新一代疫苗的研發(fā)提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。 方法: 1.采集臨床確診為肺炎鏈球菌感染的社區(qū)獲得性肺炎患者急性期(第0+3天)及恢復(fù)期(第21±3天)血清樣本,設(shè)立同期臨床確診為其它細(xì)菌感染的社區(qū)獲得性肺炎患者和同期臨床確斷無細(xì)菌侵入性感染的其它患者血清樣本為對(duì)照;酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)肺炎鏈球菌三種毒力蛋白PsaA,PspA及Ply激發(fā)機(jī)體血清特異性抗體升高情況,以期評(píng)價(jià)這三種毒力蛋白作為新一代肺炎鏈球菌疫苗候選抗原在肺炎鏈球菌經(jīng)自然途徑感染人體過程中的免疫原性。 2.分子克隆技術(shù)構(gòu)建Ply減毒突變體PdB的重組真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-PdB,并應(yīng)用RT-PCR及免疫印跡(Western-blot)方法檢測(cè)重組質(zhì)粒在哺乳動(dòng)物敘利亞倉鼠腎細(xì)胞株BHK-21中的表達(dá)。三種重組質(zhì)粒DNA疫苗pcDNA3.1-PdB(本課題構(gòu)建)和pcDNA3.1-PsaA(本研究組前期構(gòu)建)和pcDNA3.1-PspA’(本研究組前期構(gòu)建,PspA’為PspA的N端表位決定簇所在區(qū)域基因片段)以單獨(dú)或不同的組合方式(pcDNA3.1-PsaA+pcDNA3.1-PspA’, pcDNA3.1-PspA’+pcDNA3.1-PdB, pcDNA3.1-PsaA + pcDNA3.1-PdB,pcDNA3.1-PsaA + pcDNA3.1-PspA’+ pcDNA3.1-PdB)肌肉注射免疫BALB/c小鼠,設(shè)立空質(zhì)粒及PBS組為對(duì)照組,ELISA檢測(cè)免疫小鼠血清中三種蛋白特異性抗體IgG水平;復(fù)制BALB/c小鼠肺炎鏈球菌D39株鼻咽部攜帶模型和腹腔侵襲性感染模型,觀察免疫小鼠鼻咽部肺炎鏈球菌攜帶改變和腹腔攻擊小鼠21天生存情況,以期篩選出優(yōu)勢(shì)的靶抗原蛋白及其組合方式。 3.采用分子遺傳學(xué)方法和免疫學(xué)技術(shù)進(jìn)一步初步分析肺炎鏈球菌第三代疫苗優(yōu)勢(shì)抗原蛋白的分子進(jìn)化特點(diǎn)及抗原多樣性。 ⑴采集上呼吸道共生環(huán)境中的臨床致病輕鏈球菌家族菌株(包含肺炎鏈球菌、輕鏈球菌、口腔鏈球菌、血鏈球菌、嬰兒鏈球菌),PCR技術(shù)探查臨床致病輕鏈球菌家族菌株基因組中PsaA基因分布情況,應(yīng)用生物信息學(xué)技術(shù)比對(duì)所有PsaA基因的氨基酸序列及蛋白結(jié)構(gòu)差異;進(jìn)一步應(yīng)用分子遺傳學(xué)技術(shù)構(gòu)建基于看家基因及PsaA基因的系統(tǒng)發(fā)生樹,并檢測(cè)PsaA基因內(nèi)重組情況,以分析PsaA在輕鏈球菌家族中可能的遺傳機(jī)制。 ⑵采集本地區(qū)臨床致病肺炎鏈球菌感染菌株及患者恢復(fù)期(第21±3天)血清樣本,設(shè)立同期確診為非感染性疾病患者血清樣本為對(duì)照組;應(yīng)用PspA家族分型特異性引物PCR鑒定本地區(qū)臨床自然感染肺炎鏈球菌株P(guān)spA家族分布特點(diǎn), ELISA檢測(cè)臨床肺炎鏈球菌自然感染情況下各家族亞類間抗原抗體交叉反應(yīng)情況,分析肺炎鏈球菌PspA作為新一代肺炎鏈球菌疫苗優(yōu)勢(shì)候選抗原應(yīng)包含的組成成分。 結(jié)果: 1.臨床肺炎鏈球菌自然感染患者血清PspA、Ply及PsaA特異性抗體IgG水平 ⑴實(shí)驗(yàn)組急性期血清三種肺炎鏈球菌毒力蛋白特異性IgG抗體水平與對(duì)照組間無顯著性差異(P0.05);實(shí)驗(yàn)組恢復(fù)期血清的三種肺炎鏈球菌毒力蛋白特異性IgG抗體水平均高于對(duì)照組相應(yīng)的抗體水平(P0.01)。 ⑵實(shí)驗(yàn)組恢復(fù)期血清三種肺炎鏈球菌毒力蛋白特異性IgG抗體水平明顯高于急性期血清抗體水平(P0.01),其中PspA和Ply蛋白抗原特異性抗體水平升高更顯著。 2.三種肺炎鏈球菌毒力蛋白DNA疫苗免疫原性及免疫保護(hù)效能 ⑴三種肺炎鏈球菌毒力蛋白DNA疫苗免疫小鼠血清中特異性抗體水平 ①三種肺炎鏈球菌毒力蛋白DNA疫苗以兩種蛋白形式組合的聯(lián)合免疫組中, PspA’和PsaA的DNA疫苗聯(lián)合免疫組(pcDNA3.1-PsaA+pcDNA3.1-PspA’組)較單獨(dú)免疫組(pcDNA3.1-PsaA組,pcDNA3.1-PspA’組)小鼠血清中激發(fā)的針對(duì)PspA’和PsaA蛋白的特異性抗體水平更高(P0.01);而PdB分別與PspA’和PsaA聯(lián)合的DNA疫苗免疫組(pcDNA3.1-PspA’+pcDNA3.1-PdB, pcDNA3.1-PsaA + pcDNA3.1-PdB)與單獨(dú)免疫組(pcDNA3.1-PdB組)比較小鼠血清中激發(fā)的針對(duì)PdB蛋白的特異性抗體水平無顯著性差異(P0.05)。 ②三種肺炎鏈球菌毒力蛋白DNA疫苗以三種蛋白形式組合的聯(lián)合免疫組( pcDNA3.1-PsaA + pcDNA3.1-PspA’+ pcDNA3.1-PdB組)較單獨(dú)免疫組(pcDNA3.1-PsaA組,pcDNA3.1-PspA’組,pcDNA3.1-PdB組)和PdB分別與PspA’和PsaA聯(lián)合的DNA疫苗免疫組(pcDNA3.1-PspA’+pcDNA3.1-PdB, pcDNA3.1-PsaA + pcDNA3.1-PdB組)小鼠血清中針對(duì)PsaA和PsaA蛋白的特異性抗體水平更高(P0.01),而針對(duì)PdB蛋白的特異性抗體水平無顯著性差異(P0.05);但與PsaA和PspA’聯(lián)合免疫組(pcDNA3.1-PsaA+pcDNA3.1-PspA’)比較小鼠血清中針對(duì)PsaA和PspA’蛋白的特異性抗體水平無顯著性差異(P0.05)。 ⑵三種肺炎鏈球菌毒力蛋白DNA疫苗免疫保護(hù)效能 ①免疫小鼠鼻咽部定殖7天后鼻腔灌洗液菌落計(jì)數(shù)提示:PsaA和PspA’聯(lián)合免疫組( pcDNA3.1-PsaA + pcDNA3.1-PspA’)較單獨(dú)免疫組( pcDNA3.1-PsaA組,pcDNA3.1-PspA’組,pcDNA3.1-PdB組)和PdB分別與PspA’和PsaA聯(lián)合的DNA疫苗免疫組(pcDNA3.1-PspA’+pcDNA3.1-PdB, pcDNA3.1-PsaA + pcDNA3.1-PdB)小鼠鼻咽部肺炎鏈球菌數(shù)量較少更明顯(P0.01),并且與三種蛋白聯(lián)合免疫組(pcDNA3.1-PsaA+pcDNA3.1-PspA’+ pcDNA3.1-PdB組)間無顯著差異(P0.05)。 ②免疫小鼠28天后致死劑量的肺炎鏈球菌強(qiáng)毒株D39腹腔攻擊21天生存情況分析提示:PsaA和PspA’聯(lián)合免疫組(pcDNA3.1-PsaA+pcDNA3.1-PspA’)較單獨(dú)免疫組(pcDNA3.1-PsaA組,pcDNA3.1-PspA’組,pcDNA3.1-PdB組)和PdB分別與PspA’和PsaA聯(lián)合的DNA疫苗免疫組(pcDNA3.1-PspA’+pcDNA3.1-PdB, pcDNA3.1-PsaA + pcDNA3.1-PdB)小鼠中位生存時(shí)間延長更明顯(P0.01),生存曲線明顯差異,并且與三種蛋白聯(lián)合免疫組(pcDNA3.1-PsaA+pcDNA3.1-PspA’+ pcDNA3.1-PdB組)間小鼠中位生存時(shí)間相同,生存曲線相似。 3.肺炎鏈球菌PsaA基因的種群基因起源進(jìn)化分析提示PsaA基因在臨床分離的輕鏈球菌群菌株中的廣泛存在,但是僅僅在肺炎鏈球菌屬中PsaA基因是垂直遺傳的,其它的輕鏈球菌群菌株中PsaA基因可能來源于共生環(huán)境中基因的水平轉(zhuǎn)移,并且推測(cè)PsaA基因之間的差異可能與BOX元件的參與及轉(zhuǎn)移后發(fā)生的頻繁的基因內(nèi)重組現(xiàn)象相關(guān)。 4.肺炎鏈球菌PspA區(qū)域基因組學(xué)分析提示本地區(qū)PspA家族分布趨勢(shì)為:PspA-Fam1-Clade2(31.0%)和PspA-Fam2-Clade3(47.6%)的菌株作為優(yōu)勢(shì)分布。并且在本地區(qū)所有侵入性肺炎鏈球菌感染患者血清中針對(duì)PspA-Fam1特異性抗體水平高于針對(duì)PspA-Fam2的特異性抗體水平,血清PspA抗體與PspA蛋白6種亞類抗原的交叉反應(yīng)發(fā)現(xiàn)異家族各亞類間交叉反應(yīng)弱,但同家族亞類間顯著交叉反應(yīng)以PspA-Fam1-Clade1和PspA-Fam2-Clade3為優(yōu)勢(shì)。 結(jié)論: 1.PsaA,PspA及Ply在人體經(jīng)自然途徑的肺炎鏈球菌感染中作為具有良好免疫原性的肺炎鏈球菌菌體成分可作為新一代肺炎鏈球菌疫苗的理想侯選抗原。 2.PspA’聯(lián)合PsaA的抗原組合方式具有等效于PsaA,PspA’及PdB(Ply的減毒突變體)三種抗原組合方式的免疫效能,對(duì)肺炎鏈球菌的鼻咽部定植及侵入性感染均具有高效的協(xié)同保護(hù)效能,又避免了PdB存在的弱毒性問題,是肺炎鏈球菌新一代疫苗靶抗原的優(yōu)勢(shì)候選抗原組合。 3.PsaA作為肺炎鏈球菌新一代疫苗優(yōu)勢(shì)候選抗原組合成分之一,其基因在肺炎鏈球菌屬是垂直遺傳的。推論它作為一種重要的黏附因子,在細(xì)菌對(duì)鼻咽部上皮的黏附中發(fā)揮重要作用而容易被共生環(huán)境的同種群的其它鏈球菌通過水平基因轉(zhuǎn)移及基因內(nèi)重組方式獲得。 4.PspA作為肺炎鏈球菌新一代疫苗優(yōu)勢(shì)候選抗原組合成分之一,抗原多樣性存在地域差異和亞類間抗原抗體交叉反應(yīng)差異,靶抗原成分應(yīng)同時(shí)包括本區(qū)域產(chǎn)生高保護(hù)性抗體效價(jià)和強(qiáng)交叉反應(yīng)的Fam1及Fam2的優(yōu)勢(shì)Clade亞類成分才能針對(duì)性的覆蓋臨床致病肺炎鏈球菌菌株感染。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R392.1

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本文編號(hào)：2457764