【摘要】： 樹突狀細(xì)胞(Dendritic cell, DC)是目前已知的體內(nèi)功能最強(qiáng)大的專職抗原提呈細(xì)胞,能夠整合一系列的外來(lái)病原體信號(hào)并將其傳遞給淋巴細(xì)胞,啟動(dòng)合適的免疫應(yīng)答反應(yīng)。未成熟DC在微生物感染或移植后識(shí)別、吞噬外源性抗原,可快速成熟。成熟DC的吞噬能力減弱,但細(xì)胞表面共刺激分子和粘附分子的表達(dá)上調(diào),并分泌促炎癥細(xì)胞因子,啟動(dòng)初始的T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答反應(yīng)。近年來(lái),越來(lái)越多的研究表明DC是一種異質(zhì)性的細(xì)胞群體,分布于不同的解剖部位,含有不同的細(xì)胞亞群,處于不同的成熟階段,表達(dá)不同的表型和細(xì)胞因子,其功能也是多樣性的。其中,具有負(fù)向免疫調(diào)控作用的DC亞群的發(fā)現(xiàn)及其功能特點(diǎn)與作用機(jī)制的研究是該領(lǐng)域近年來(lái)的重要進(jìn)展之一,此類具有負(fù)向免疫調(diào)控作用的DC亞群被稱為調(diào)節(jié)性DC (Regulatroy DC)。目前認(rèn)為,調(diào)節(jié)性DC主要通過選擇性的誘導(dǎo)Th2型的免疫應(yīng)答或促使初始CD4~+和CD8~+ T細(xì)胞分化為分泌IL-10的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞來(lái)負(fù)向調(diào)控免疫應(yīng)答。 在前期的研究中,我們發(fā)現(xiàn)以往被認(rèn)為終末分化細(xì)胞的成熟DC,與脾基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)后能夠進(jìn)一步增殖并分化為一類能夠通過分泌NO而抑制T細(xì)胞增殖的新型調(diào)節(jié)性樹突狀細(xì)胞,我們將之命名為“分化樣樹突狀細(xì)胞”(Differentiated dendritic cell,diffDC),從而提出了成熟DC并非均為終末分化細(xì)胞的觀點(diǎn),其在完成了抗原遞呈任務(wù)之后,在次級(jí)淋巴器官微環(huán)境的作用下,仍能夠進(jìn)一步增殖分化,從而被賦予了新的生命與功能。我們進(jìn)一步對(duì)于diffDC這一新型調(diào)節(jié)性DC亞群的性質(zhì)與功能特點(diǎn)進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)了ERK的高度磷酸化和p38的低活化與diffDC的獨(dú)特細(xì)胞因子譜(高表達(dá)IL-10而低表達(dá)IL-12)的表達(dá)密切相關(guān)。在不同的生理或病理情況下,diffDC與周圍很多免疫細(xì)胞存在相互作用,彼此精密調(diào)節(jié),例如可以通過分泌IL-10活化NK細(xì)胞而導(dǎo)致自身的殺傷,并通過分泌IP-10選擇性地趨化Th1細(xì)胞并抑制其增殖,從而維持機(jī)體的穩(wěn)態(tài)。而B細(xì)胞是免疫系統(tǒng)中的一種主要細(xì)胞,能夠通過產(chǎn)生抗體在體液免疫中發(fā)揮著中心作用,也可以作為抗原提呈細(xì)胞,通過產(chǎn)生細(xì)胞因子,提供抗原信息和共刺激信號(hào)以促進(jìn)CD4~+ T細(xì)胞向Th1還是Th2分化,來(lái)調(diào)節(jié)CD4~+ T細(xì)胞對(duì)外來(lái)或自身抗原的免疫反應(yīng)。在脾臟淋巴細(xì)胞中B細(xì)胞約占50%,在免疫反應(yīng)的后期,脾臟中的具有獨(dú)特調(diào)節(jié)功能的diffDC有可能會(huì)與B細(xì)胞相遇。那么diffDC能否作用于B細(xì)胞,調(diào)控B細(xì)胞的功能?如果具備此功能,其生物學(xué)意義及其相關(guān)的作用機(jī)制又是什么呢? 鑒于目前尚未見調(diào)節(jié)性DC參與B細(xì)胞功能調(diào)控的報(bào)道,我們?cè)诒狙芯恐蟹譃閮刹糠謨?nèi)容,分別圍繞調(diào)節(jié)性DC對(duì)B細(xì)胞的調(diào)控作用及其相關(guān)的機(jī)制進(jìn)行了探討。 一、調(diào)節(jié)性樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)高分泌IL-10的新型調(diào)節(jié)性B細(xì)胞的產(chǎn)生 在本部分實(shí)驗(yàn)中,我們研究了調(diào)節(jié)性DC(diffDC)對(duì)B細(xì)胞功能的調(diào)控作用。首先,我們將diffDC在體外與脾臟來(lái)源的B細(xì)胞共培養(yǎng),觀察共培養(yǎng)后,B細(xì)胞的增殖、抗體分泌和凋亡情況。結(jié)果表明,diffDC不能引起B(yǎng)細(xì)胞凋亡,對(duì)B細(xì)胞的增殖也沒有明顯影響。與imDC和maDC一樣,diffDCs也能誘導(dǎo)B細(xì)胞分泌IgM和IgG,這與原來(lái)文獻(xiàn)報(bào)道DCs可誘導(dǎo)B細(xì)胞合成IgM和IgG是一致的。我們又進(jìn)一步檢測(cè)了diffDC對(duì)B細(xì)胞分泌細(xì)胞因子譜的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),diffDCs不影響B(tài)細(xì)胞分泌IL-12、IFN-γ、IL-6、IP-10、PGE2和TGF-β等細(xì)胞因子,但是讓我們感興趣的是,diffDC和B細(xì)胞共培養(yǎng)后產(chǎn)生的IL-10水平顯著高于imDC或maDC與B細(xì)胞共培養(yǎng)對(duì)照組。diffDC與B細(xì)胞按不同的比例共培養(yǎng)均能誘導(dǎo)高水平的IL-10分泌,其中diffDC和B共培養(yǎng)比例為1:5的情況下,所誘導(dǎo)產(chǎn)生的IL-10水平最高,1:10的共培養(yǎng)比例次之。由于1:10的diffDC與B細(xì)胞共培養(yǎng)比例更接近于體內(nèi)DC和B細(xì)胞的比例,因此,我們?cè)陔S后的實(shí)驗(yàn)體系中均選擇了這一比例進(jìn)行DC和B細(xì)胞的共培養(yǎng)。diffDC和B細(xì)胞共培養(yǎng)后24小時(shí)IL-10的分泌就出現(xiàn)顯著升高,48小時(shí)達(dá)到高峰。胞內(nèi)染色流式檢測(cè)確證IL-10主要來(lái)源于B細(xì)胞。以上結(jié)果提示我們,diffDC有可能作用于B細(xì)胞,誘導(dǎo)B細(xì)胞向高分泌IL-10的調(diào)節(jié)性B細(xì)胞分化。 隨后我們探討了diffDC能否對(duì)B細(xì)胞的表型產(chǎn)生影響。我們用流式篩選了一系列的膜表面分子,最后發(fā)現(xiàn)diffDC誘導(dǎo)B細(xì)胞高表達(dá)CD19、CD16/CD32和CD62L。由于熒光標(biāo)記的抗CD16/CD32單抗能識(shí)別活化型受體FcγRIII (CD16), FcγRIIa (CD32a)和抑制型受體FcγRIIb (CD32b),因此,我們利用流式分選出共培養(yǎng)體系中的CD19~(hi)CD16/CD32~(hi)的B細(xì)胞,提取其總RNA,RT-PCR的方法證實(shí)了diffDC誘導(dǎo)B細(xì)胞高表達(dá)的CD32分子是抑制型受體FcγRIIb。 下一步我們想知道是不是diffDC所誘導(dǎo)的這群CD19~(hi)FcγRIIb~(hi)的B細(xì)胞產(chǎn)生了高水平的IL-10。我們利用流式分選出共培養(yǎng)體系中CD19~(hi)FcγRIIb~(hi)和CD19~(lo)FcγRIIb~(lo)的B細(xì)胞,在體外分別用TLR3配體(polyI:C)、TLR4配體(LPS)、TLR9配體(CpG ODN)刺激24小時(shí),結(jié)果發(fā)現(xiàn)CD19~(hi)FcγRIIb~(hi) B細(xì)胞分泌IL-10的水平顯著高于CD19~(lo)FcγRIIblo B細(xì)胞,LPS刺激可促進(jìn)CD19~(hi)FcγRIIb~(hi) B細(xì)胞分泌更高水平的IL-10。綜合以上的結(jié)果,我們認(rèn)為diffDC誘導(dǎo)的高分泌IL-10的調(diào)節(jié)性B細(xì)胞具有獨(dú)特的表型,即CD19~(hi)FcγRIIb~(hi),這種表型與以往文獻(xiàn)報(bào)道的調(diào)節(jié)性B細(xì)胞的表型均不一致,可確定其為一類新型調(diào)節(jié)性B細(xì)胞亞群。 綜上所述,在本部分實(shí)驗(yàn)中,我們發(fā)現(xiàn)diffDC可以誘導(dǎo)脾臟B細(xì)胞分化為高分泌IL-10的具有獨(dú)特表型(CD19~(hi)FcγRIIb~(hi))的新型調(diào)節(jié)性B細(xì)胞亞群。 二、新型調(diào)節(jié)性B細(xì)胞的產(chǎn)生機(jī)制及相關(guān)功能研究 在本部分實(shí)驗(yàn)中,我們研究了diffDC所誘導(dǎo)的CD19~(hi)FcγRIIb~(hi)調(diào)節(jié)性B細(xì)胞的相關(guān)功能以及difffDCs誘導(dǎo)其產(chǎn)生的機(jī)制,并在體內(nèi)證實(shí)了這類CD19~(hi)FcγRIIb~(hi)調(diào)節(jié)性B細(xì)胞的存在。 由于diffDC誘導(dǎo)的這類新型調(diào)節(jié)性B細(xì)胞亞群高表達(dá)FcγRIIb,而FcγRIIb作為重要的抑制性受體,可以介導(dǎo)吞噬,發(fā)揮免疫負(fù)向調(diào)節(jié)作用。因此,我們利用流式檢測(cè)了diffDC所誘導(dǎo)的這群CD19~(hi)FcγRIIb~(hi)調(diào)節(jié)性B細(xì)胞對(duì)免疫復(fù)合物(IC)的吞噬能力。結(jié)果表明,CD19~(hi)FcγRIIb~(hi)調(diào)節(jié)性B細(xì)胞與常規(guī)脾臟B細(xì)胞相比,吞噬IC的能力明顯增強(qiáng)。隨后我們利用FcγRIIb缺陷小鼠制備調(diào)節(jié)性B細(xì)胞,結(jié)果發(fā)現(xiàn),FcγRIIb缺陷后,調(diào)節(jié)性B細(xì)胞吞噬IC的能力顯著下降,表明FcγRIIb受體介導(dǎo)了CD19~(hi)FcγRIIb~(hi)調(diào)節(jié)性B細(xì)胞對(duì)IC的吞噬。我們進(jìn)一步檢測(cè)了CD19~(hi)FcγRIIb~(hi)調(diào)節(jié)性B細(xì)胞對(duì)特異性抗原肽活化后的CD4+ T細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果表明,與CD19~(lo)FcγRIIblo B細(xì)胞相比,CD19~(hi)FcγRIIb~(hi) B細(xì)胞能夠顯著抑制抗原特異性T細(xì)胞的增殖反應(yīng),但不影響活化T細(xì)胞分泌IL-2和IFN-γ。以上結(jié)果表明,CD19~(hi)FcγRIIb~(hi)調(diào)節(jié)性B細(xì)胞可以通過吞噬IC以及抑制抗原特異性T細(xì)胞的增殖反應(yīng)從而發(fā)揮免疫負(fù)向調(diào)控作用。 為了探討diffDCs誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性B細(xì)胞的產(chǎn)生機(jī)制,我們利用transwell系統(tǒng)將diffDC與B細(xì)胞隔離培養(yǎng),結(jié)果發(fā)現(xiàn)diffDC誘導(dǎo)B細(xì)胞產(chǎn)生IL-10既需要可溶性因子介導(dǎo),也需要細(xì)胞間的直接接觸。在前期的研究中,我們已證實(shí)diffDC可高分泌IL-10、IL-6、IP-10、IFN-β和NO等可溶性因子,因此,我們使用IL-10缺陷小鼠制備diffDC或者預(yù)先用中和性抗體以及NO合成酶抑制劑PBIT中和這些細(xì)胞因子和NO的效應(yīng),然后與B細(xì)胞共培養(yǎng),結(jié)果發(fā)現(xiàn)用抗IFN-β的中和性抗體和PBIT預(yù)先處理過的diffDC與B細(xì)胞共培養(yǎng)后產(chǎn)生IL-10的水平顯著降低,表明diffDC誘導(dǎo)調(diào)節(jié)B細(xì)胞高分泌IL-10是由diffDC所產(chǎn)生的IFN-β和NO所介導(dǎo)的。下一步我們探索了diffDC上哪些膜分子介導(dǎo)了調(diào)節(jié)性B細(xì)胞高分泌IL-10。由于diffDC表達(dá)CD40L和B7H1,我們將CD40缺陷的B細(xì)胞與diffDC共培養(yǎng),或者在diffDC與B細(xì)胞共培養(yǎng)體系中加入抗B7H1的中和性抗體,結(jié)果發(fā)現(xiàn)diffDC與CD40缺陷小鼠共培養(yǎng)后產(chǎn)生的IL-10的水平顯著降低,表明diffDC上的CD40L和B細(xì)胞上的CD40直接接觸也參與介導(dǎo)了diffDC誘導(dǎo)調(diào)節(jié)B細(xì)胞高分泌IL-10。 為了明確我們?cè)隗w外用diffDC誘導(dǎo)的CD19~(hi)FcγRIIb~(hi)調(diào)節(jié)性B細(xì)胞是否在小鼠體內(nèi)存在相應(yīng)的亞群,我們利用磁珠分選小鼠的脾臟和淋巴結(jié)CD19+ B細(xì)胞,利用流式檢測(cè)證實(shí)了小鼠體內(nèi)存在著這類CD19~(hi)FcγRIIb~(hi) B細(xì)胞。進(jìn)一步通過從體內(nèi)分選出CD19~(hi)FcγRIIb~(hi) B細(xì)胞并對(duì)其功能進(jìn)行了分析,研究表明,無(wú)論是小鼠脾臟還是淋巴結(jié)中的CD19~(hi)FcγRIIb~(hi) B細(xì)胞,都與體外diffDC所誘導(dǎo)產(chǎn)生的新型CD19~(hi)FcγRIIb~(hi)調(diào)節(jié)性B細(xì)胞亞群的功能類似,可以高分泌IL-10,對(duì)IC的吞噬能力增強(qiáng)以及抑制抗原特異性CD4+ T細(xì)胞的增殖,從而證明小鼠體內(nèi)存在著這類我們發(fā)現(xiàn)的新型CD19~(hi)FcγRIIb~(hi) B細(xì)胞。 綜上所述,在本部分實(shí)驗(yàn)中,我們發(fā)現(xiàn)diffDC可通過產(chǎn)生IFN-β和NO以及表達(dá)的CD40L作用于B細(xì)胞,誘導(dǎo)其分化為高分泌IL-10并具有CD19~(hi)Fc?RIIb~(hi)表型特征的調(diào)節(jié)性B細(xì)胞。diffDC所誘導(dǎo)的CD19~(hi)Fc?RIIb~(hi)調(diào)節(jié)性B細(xì)胞對(duì)IC的吞噬能力增強(qiáng),并且可以抑制抗原特異性T細(xì)胞的增殖反應(yīng)。最后,我們?cè)谛∈篌w內(nèi)證實(shí)了這群調(diào)節(jié)性B細(xì)胞的存在。 總之,我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,diffDC可通過分泌IFN-β和NO以及CD40L/CD40相互作用而誘導(dǎo)脾臟B細(xì)胞分化為高分泌IL-10的具有獨(dú)特表型(CD19~(hi)Fc?RIIb~(hi))的新型調(diào)節(jié)性B細(xì)胞亞群,從而進(jìn)一步擴(kuò)大了其獨(dú)特的免疫負(fù)向調(diào)控功能。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果豐富了對(duì)免疫微環(huán)境負(fù)向調(diào)控整個(gè)免疫應(yīng)答多細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)的認(rèn)識(shí),為今后進(jìn)一步研究新型調(diào)節(jié)性DC(diffDC)參與免疫負(fù)向調(diào)控的機(jī)制提供了新的方向和一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ),為探索腫瘤、自身耐受和自身免疫性疾病等的發(fā)生機(jī)制及免疫治療的應(yīng)用提供了新的研究途徑。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R392

【引證文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2456656