【摘要】：蟲媒病毒（Arthropod-borne viruses, Arboviruses）是一大類通過吸血節(jié)肢動(dòng)物叮咬易感脊椎動(dòng)物而傳播的病毒，能引起嚴(yán)重的人畜共患性疾病。隨著全球氣候轉(zhuǎn)暖、疫源地變遷，未知、新發(fā)的蟲媒病毒層出不窮。蟲媒病毒的傳播和流行給人類健康和經(jīng)濟(jì)生產(chǎn)的影響不斷顯現(xiàn)�？焖�、準(zhǔn)確的檢出、發(fā)現(xiàn)蟲媒病毒對于臨床診斷和監(jiān)測流行狀態(tài)都具有十分重要的意義。目前已知的蟲媒病毒種類已達(dá)上百種，主要分布于黃病毒（Flaviviridae）、布尼亞病毒（Bunyaviridae）和披膜病毒（Togaviridae）三大群成員。蟲媒病毒多樣性高的特點(diǎn)是病毒檢測的一大難題，經(jīng)典的病毒分離培養(yǎng)方法繁瑣，，耗時(shí)長、人力成本高，對操作人員經(jīng)驗(yàn)和技術(shù)都有很高要求；血清學(xué)方法需要病毒特異性抗原或抗體。目前，病毒的核酸檢測方法更為普及，常規(guī)的PCR與熒光定量PCR、核酸雜交以及在此基礎(chǔ)上發(fā)展起來的基因芯片等，都依賴于病毒基因組序列的獲得，對于檢測新發(fā)甚至完全未知的病毒存在較大局限性。近年來發(fā)展起來的高通量測序（High-throughput sequencing）技術(shù)能夠同時(shí)對待測樣本中兆級數(shù)量的核酸分子進(jìn)行測序，不依賴病毒的分離培養(yǎng)，尤其適合從混雜的臨床或環(huán)境樣本中發(fā)現(xiàn)重要的病原微生物，成為鑒定未知病原體的較為有效的技術(shù)手段。 在蜱、蚊等媒介節(jié)肢動(dòng)物體內(nèi)，蟲媒病毒感染宿主細(xì)胞后可被宿主RNA干擾機(jī)制識(shí)別，產(chǎn)生大量的病毒源性小干擾RNA(virus-derived small interfering RNA, vsRNA)，是宿主抵御病毒感染的重要機(jī)制。vsRNA本質(zhì)上是經(jīng)宿主細(xì)胞酶切加工的病毒基因組微小片段，通過拼接即可將其還原成為全長的病毒基因組序列。我國新疆地區(qū)生態(tài)景觀多樣，氣候類型復(fù)雜，存在多處自然疫源地，媒介節(jié)肢動(dòng)物種類繁多，分布廣泛。本研究對取自新疆維吾爾自治區(qū)夏爾西里自然保護(hù)區(qū)的蜱標(biāo)本進(jìn)行vsRNA高通量測序，對蜱自然攜帶的蟲媒病毒進(jìn)行篩查，通過對高通量測序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，快速、準(zhǔn)確地了解自然疫源地主要存在的蟲媒病毒種類，并進(jìn)一步通過常規(guī)方法對高通量測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)的蟲媒病毒進(jìn)行鑒定�；诓《驹葱孕NA的高通量測序技術(shù)可為蟲媒病毒的甄檢和我國自然疫源地的本底調(diào)查提供一種新的途徑。 本研究首先對采集到的蜱進(jìn)行總RNA和小RNA提取，將小RNA進(jìn)行高通量測序，對所得到的高通量測序數(shù)據(jù)進(jìn)行基礎(chǔ)分析。高通量測序共得到蜱小RNA有效數(shù)據(jù)為17558502個(gè)讀序，去除重復(fù)讀序并采用比對到全病毒基因組和組裝病毒這兩種策略進(jìn)行病毒分析，其中32631個(gè)讀序比對到病毒基因組，豐度值最高的為蜱傳腦炎病毒讀序。 將蜱蟲的研磨液接入BHK-21細(xì)胞培養(yǎng)，盲傳3代后細(xì)胞出現(xiàn)圓縮、脫落等典型的細(xì)胞病變現(xiàn)象，分離毒株獲取病毒核酸后用黃病毒屬通用引物、TBEV特異引物對該病毒株進(jìn)行RT-PCR，結(jié)果顯示核酸為陽性，上述結(jié)果初步證實(shí)我們分離得到的病毒是一株蜱傳腦炎病毒。我們利用分段擴(kuò)增的方法獲得病毒的全基因組序列，全長為11103nt，其中5’末端非編碼區(qū)長為131nt，3’末端非編碼區(qū)長為727nt，將其命名為TBEV-XinJiang01，全序列信息公布于Genbank，登錄號為JX534167。首先對該毒株基因組編碼區(qū)構(gòu)建進(jìn)化樹進(jìn)行序列分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)它屬于TBEV遠(yuǎn)東亞型，與俄羅斯境內(nèi)的兩株毒株較為接近，與我國東北分離株之間還存在著一定的差異，編碼區(qū)序列中存在一些可能具有生物學(xué)意義的氨基酸變異位點(diǎn)；然后對3’非編碼區(qū)構(gòu)建進(jìn)化樹進(jìn)行序列分析，發(fā)現(xiàn)它與歐洲亞型和西伯利亞亞型更為接近，而與我國東北株為代表的遠(yuǎn)東亞型之間差異較大，具體序列差異表現(xiàn)為蜱傳腦炎新疆株有著更長的3’非編碼區(qū)序列。進(jìn)一步對新疆地區(qū)分離得到的蜱傳腦炎新疆株和我國東北地區(qū)發(fā)現(xiàn)的蜱傳腦炎病毒牡丹江株進(jìn)行了相關(guān)復(fù)制特性的比較，初步證實(shí)在相同條件下，蜱傳腦炎病毒新疆株的增殖能力要弱于我國東北地區(qū)的蜱傳腦炎病毒牡丹江株。本研究是首次報(bào)道并從我國新疆地區(qū)分離到蜱傳腦炎病毒。 另外，本研究對蜱傳腦炎病毒和乙型腦炎病毒的兩個(gè)候選診斷抗原應(yīng)用臨床陽性血清進(jìn)行了評價(jià)。首先針對蜱傳腦炎病毒的EDⅢ區(qū)域和乙型腦炎病毒的EDⅢ區(qū)域設(shè)計(jì)特異性的PCR擴(kuò)增引物，通過RT-PCR擴(kuò)增兩種病毒的RNA獲得目標(biāo)產(chǎn)物，并分別構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒，在E.coli BL21中表達(dá)，獲得目的抗原并進(jìn)行純化。將純化得到的蜱傳腦炎病毒EDⅢ抗原和乙型腦炎病毒EDⅢ抗原進(jìn)行系列稀釋后同時(shí)點(diǎn)制在ELISA微孔板中，采用Array-ELISA技術(shù)同時(shí)檢測這些臨床病人血清及正常人血清，其中針對55份臨床TBE病人血清樣本檢測到36份TBEV感染陽性，檢出率為65.5%；針對8份臨床JE病人血清樣本檢測到5份JEV感染陽性，檢出率為62.5%；正常人血清檢測結(jié)果全部為陰性。實(shí)驗(yàn)所使用的臨床蜱傳腦炎病人感染血清樣本和臨床乙型腦炎病人感染血清均曾采用全病毒免疫熒光法檢測到血清中的特異性抗體，結(jié)果表明這兩種抗原用于臨床患者的診斷具有較好的檢測特異性，有著較高的檢出率，但同時(shí)會(huì)存在一定程度的漏檢。 本研究使用高通量測序技術(shù)鑒定蜱體內(nèi)攜帶的病毒，通過高通量測序建立小RNA庫，并將所獲得的病毒reads采用比對到病毒基因組和組裝的策略，分析得到了媒介生物體內(nèi)攜帶的部分蟲媒病毒，通過一系列常規(guī)的病毒檢測方法對高通量檢測分析結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證。同時(shí)我們對蜱傳腦炎病毒EDⅢ區(qū)域和乙型腦炎病毒EDⅢ區(qū)域的診斷價(jià)值進(jìn)行了評價(jià)，為臨床血清學(xué)診斷技術(shù)的發(fā)展及血清學(xué)檢測試劑的研制提供了理論指導(dǎo)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R373.3

【參考文獻(xiàn)】

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1 盧加舉;廖文彬;朱白婢;彭明;;MicroRNA的研究進(jìn)展[J];分子植物育種;2006年S2期

2 張國珍;譚兵;詹廷西;李青;李成;;微陣列酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)在臨床輸血檢測中的應(yīng)用[J];檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床;2009年21期

3 李志艷;閆存玲;燕榮;馮珍如;;微陣列酶聯(lián)免疫法檢測6項(xiàng)腫瘤標(biāo)志物的方法學(xué)評價(jià)[J];臨床檢驗(yàn)雜志;2009年05期

4 宋大偉;何生虎;;乙型腦炎血清學(xué)診斷方法研究進(jìn)展[J];農(nóng)業(yè)科學(xué)研究;2006年01期

5 閆麗萍;華榮虹;亓文寶;童光志;;流行性乙型腦炎病毒E蛋白結(jié)構(gòu)域Ⅲ的抗原表位鑒定與功能研究[J];生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展;2008年03期

6 彭輝兵;全智華;;RNA干擾——一種有力的基因沉默工具[J];醫(yī)學(xué)綜述;2007年03期

7 陶三菊;流行性乙型腦炎的流行監(jiān)測及預(yù)防[J];中國計(jì)劃免疫;2002年04期

本文編號：2456575