【摘要】： 當前，高致病性人禽流感病毒（H5N1）已在15個國家和地區(qū)發(fā)生，死亡率高，特別是印尼家族性感染被美國科學(xué)家證實為人傳染人事例后，使得大流行流感防控形勢異常嚴峻。WHO預(yù)言，下一次流感大流行不是有和無的問題，而是早和晚的問題。目前，高致病性人禽流感病毒H5N1感染主要分布在亞洲，特別是印尼、越南和中國，對其分離的毒株進行血清學(xué)、致病性和基因結(jié)構(gòu)等分析表明，高致病性人禽流感病毒H5N1具有高度變異的特性，就中國分離的毒株而言就存在南北之分。因此，WHO要求各國加強技術(shù)儲備，制備合格有效的人用疫苗。而疫苗研制的最關(guān)鍵因素是有效疫苗株的獲得，尤其是針對本地區(qū)病毒流行特點，制備適合當?shù)厥褂玫拇罅餍辛鞲幸呙缰辍?1999年以后Neumann等、Hoffmann等建立了完全以質(zhì)粒為基礎(chǔ)的流感病毒反向遺傳操作系統(tǒng)，顯示了對相關(guān)研究的良好應(yīng)用前景。本研究選擇一個中國大陸分離株A/xinjiang/1/2006（H5N1），對其進行全基因組序列測定和遺傳進化分析，然后將2個基因cDNA(HA、NA)克隆入Hoffmann等構(gòu)建的雙向轉(zhuǎn)錄/表達載體pHW2000，其中HA基因經(jīng)過減毒修飾，與PR8（H1N1）的內(nèi)部基因組合，用8質(zhì)粒病毒拯救系統(tǒng)產(chǎn)生了H5N1亞型基因重組病毒，從而產(chǎn)生了致弱表型的H5N1重組病毒，并對拯救的病毒作為疫苗的特點進行初步分析。我們的研究共分為三個部分：A/xinjiang/1/2006（H5N1）HA基因修飾及8質(zhì)粒系統(tǒng)的構(gòu)建、H5N1/A/xinjiang/1/2006-RG病毒株的拯救、H5N1/A/xinjiang/1/2006-RG作為疫苗株病毒的評價。 第一、A/xinjiang/1/2006（H5N1）HA基因修飾及8質(zhì)粒系統(tǒng)的構(gòu)建：在BSL-3培養(yǎng)代表中國第三進化體系的高致病性人禽流感病毒A/xinjiang/1/2006（H5N1）株，常規(guī)方法提取病毒總RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。設(shè)計帶有BsmBI、BsaI酶切位點的引物擴增A/xinjiang/1/2006（H5N1）HA、NA兩個基因全長片段，并在HA基因中共引入了基因突變，刪除可以將HA裂解為HA1、HA2的四個堿性氨基酸，，以達到降低病毒毒力的作用。將HA、NA兩個基因片段克隆入pHW2000，并進行了測序驗證和錯誤位點的修正，與PR8作為骨架病毒的6個質(zhì)粒組合為2+6的polⅠ-polⅡ系統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄/表達質(zhì)粒體系，以期通過同一個載體、轉(zhuǎn)染后利用細胞中的polⅠ和polⅡRNA聚合酶、實現(xiàn)重組病毒vRNA和mRNA的轉(zhuǎn)錄和表達。 第二、H5N1/A/xinjiang/1/2006-RG病毒株的拯救：將構(gòu)建好的2質(zhì)粒和PR8 6質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染COS-1細胞，獲得重組的H5N1/A/xinjiang/1/2006-RG疫苗株病毒。病毒轉(zhuǎn)染過程中對轉(zhuǎn)染條件進行了反復(fù)摸索，以期建立穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染體系，包括轉(zhuǎn)染試劑的選擇、細胞密度的選擇、轉(zhuǎn)染時間的探索等。經(jīng)過反復(fù)研究獲得了拯救人禽流感病毒穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染條件。對于拯救的H5N1/A/xinjiang/1/2006-RG疫苗株病毒，我們分別運用RT-PCR擴增病毒基因片段并測序來直接驗證病毒的型別；血凝實驗、間接免疫熒光實驗檢測可間接驗證病毒拯救的成功；運用電鏡來觀察病毒的形態(tài)。實驗結(jié)果表明，拯救H5N1/A/xinjiang/1/2006-RG疫苗株病毒基因序列中HA、NA序列與A/xinjiang/1/2006（H5N1）相同，其中HA裂解位點的四個堿性氨基酸已經(jīng)成功刪除；病毒血凝滴度可達到1:320以上；免疫熒光檢測可以發(fā)現(xiàn)病毒存在；電鏡下病毒形態(tài)正常，成絲狀和囊狀，與普通流感病毒形態(tài)相似。反向遺傳操作技術(shù)的建立，為進行禽流感病毒基因結(jié)構(gòu)與功能、致病性和疫苗候選株的構(gòu)建等方面的研究提供了新的手段。 第三、H5N1/A/xinjiang/1/2006-RG 疫苗株病毒的評價：運用RG技術(shù)制備的重組病毒，最終目的是運用于人用疫苗的制備。因此，對疫苗株進行評價是本研究的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，包括病毒株的穩(wěn)定性、安全性、免疫原性檢測。病毒穩(wěn)定性評價采用雞胚連續(xù)傳12代，分別檢測2、4、6、8、10、12代的病毒基因系列及EID50、血凝滴度，結(jié)果表明不同代次基因序列同源性達到99.8%，EID50為7左右，血凝滴度在1:320以上，病毒傳代穩(wěn)定，無基因突變和毒力恢復(fù)現(xiàn)象；病毒安全性檢測采用CPE、病毒蝕斑實驗、EID50、雞靜脈致病指數(shù)來檢測重組病毒毒力，拯救的疫苗株病毒其細胞病變較野毒株明顯減輕，且空斑直徑在加入TPCK胰酶為1-2mm之間，EID50為7.5，IVIP為0，所有結(jié)果都表明，我們拯救的H5N1/A/xinjiang /1/2006-RG病毒毒力明顯降低，符合WHO對大流行流感疫苗（H5N1）株的規(guī)定和要求；病毒免疫原性檢測采用動物免疫法，用純化滅活H5N1/xinjiang /1/2006-RG疫苗株肌肉免疫Balb/c小鼠，通過血凝抑制來初步驗證病毒的免疫原性，結(jié)果顯示，血凝效價兩次免疫后為1:40-1:640，兩種實驗方法的特異性抗體滴度具有相關(guān)性，說明拯救的病毒具有良好的免疫原性。以上研究表明，我們制備的H5N1/A/xinjiang /1/2006-RG疫苗株可以用于疫苗生產(chǎn)。 結(jié)論：成功的對流感病毒A/xinjiang/1/2006（H5N1）HA基因進行了定點突變，運用PR8為骨架病毒的拯救系統(tǒng)在COS-1細胞上進行高效拯救。同時，對拯救的病毒H5N1/A/xinjiang /1/2006-RG進行評價，表明拯救的疫苗株病毒具備良好的穩(wěn)定性、安全性、免疫原性。并建立了大流行流感疫苗株拯救的技術(shù)體系，為應(yīng)對流感大流行做好了技術(shù)貯備。
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【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R392

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本文編號：2453621