【摘要】： 未成熟樹突狀細(xì)胞分泌的exosomes延長(zhǎng)大鼠小腸移植受體的存活時(shí)間 第一章大鼠小腸移植模型的建立 目的建立穩(wěn)定而可靠的大鼠異位節(jié)段性小腸移植模型。 方法近交系F344大鼠為供體,近交系Wistar大鼠為受體。取帶血管的10cm-15cm左右小腸段作為供腸,帶部分腹主動(dòng)脈的腸系膜上動(dòng)脈與受體腎下腹主動(dòng)脈行端-側(cè)吻合,供體門靜脈與受體腎下下腔靜脈行端-側(cè)吻合。供腸近端結(jié)扎后固定于腹壁,遠(yuǎn)端腸管右下腹壁造瘺。 結(jié)果共進(jìn)行了56次正式實(shí)驗(yàn),在未用免疫抑制劑的情況下,50例受體存活時(shí)間超過3天,造模成功率為89.3%。供體平均手術(shù)時(shí)間(37.3±1.6)min,受體平均手術(shù)時(shí)間為(57.3±4.1)min,其中動(dòng)脈吻合(10.4±1.6)min,靜脈吻合(8.9±0.7) min,移植小腸冷缺血時(shí)間(21.9±2.1) min,熱缺血時(shí)間(19.3±2.0) min。受體大鼠(陰性對(duì)照組)生存時(shí)間最短為5d,最長(zhǎng)為8d,平均(7.0±0.6)d。 結(jié)論采用本方法建立的大鼠小腸移植模型穩(wěn)定、可靠、成功率高,為后續(xù)實(shí)驗(yàn)打下了基礎(chǔ)。 第二章未成熟樹突狀細(xì)胞(imDC)分泌的exosomes制備與鑒定 目的探討體外誘導(dǎo)和擴(kuò)增大鼠骨髓來(lái)源imDC,分離純化imDC分泌的exosomes(imDex)的方法,并從形態(tài)學(xué)、分子表型和免疫學(xué)功能等方面對(duì)imDex予以鑒定。 方法無(wú)菌條件下獲取大鼠骨髓前體細(xì)胞,在GM-CSF(5ng/ml)+IL-4(5ng/ml)條件下進(jìn)行體外誘導(dǎo)、擴(kuò)增,隔日半量換液,第6天收獲細(xì)胞。通過倒置顯微鏡及電鏡觀察細(xì)胞形態(tài),流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面分子表達(dá)情況,ELISA檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清細(xì)胞因子含量,鑒定收獲的細(xì)胞是否為imDC。再此基礎(chǔ)上,收集培養(yǎng)6天的imDC細(xì)胞上清,超速離心法分離imDex,膜超濾離心法純化除菌。透射電鏡觀察imDex形態(tài),流式細(xì)胞儀檢測(cè)imDex膜表面分子表達(dá)情況,混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR)進(jìn)行imDex功能學(xué)檢測(cè)。 結(jié)果培養(yǎng)至第6天可獲得imDC。電鏡下可見細(xì)小樹突狀突起,流式細(xì)胞儀檢測(cè)表明imDC低表達(dá)MHCII、CD80、CD86及CD40分子,ELISA檢測(cè)顯示imDC分泌促炎性細(xì)胞因子IL-12p70能力顯著低于成熟DC(mDC)。超速離心imDC細(xì)胞上清可分離獲得imDC分泌的imDex。膜超濾離心純化除菌后透射電鏡下觀察可見imDex為直徑介于50-100nm,具有典型脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)的小囊泡。流式細(xì)胞儀檢測(cè)表明imDex高表達(dá)MHCII分子,低表達(dá)或不表達(dá)CD80、CD86及CD40分子。MLR檢測(cè)顯示imDex在imDC的輔助下刺激T淋巴細(xì)胞增殖的能力顯著低于成熟DC(mDC)分泌的exosomes(mDex)。 結(jié)論本法是體外制備大鼠骨髓來(lái)源imDC分泌的imDex的有效方法,為后續(xù)實(shí)驗(yàn)打下了基礎(chǔ)。 第三章ImDC分泌的exosomes延長(zhǎng)大鼠小腸移植受體的生存時(shí)間及相關(guān)機(jī)制 目的探討靜脈輸注供體imDex能否有效的延長(zhǎng)大鼠小腸移植受體的存活時(shí)間,并進(jìn)一步研究imDex誘導(dǎo)移植免疫耐受的可能機(jī)制。 方法供體為F344大鼠,受體為Wistar大鼠,供受體間進(jìn)行異位節(jié)段性小腸移植。首先根據(jù)受體接受不同劑量供體來(lái)源的imDex處理將受體大鼠分為5組,A組(未處理組,n=6):移植前1周注射1ml生理鹽水;B組(n=6):移植前1周注射含供體1μg imDex混懸液1ml;C組(n=6):移植前1周注射含供體10μg imDex混懸液1ml;D組(n=6):移植前1周注射含供體20μg imDex的混懸液1ml;E(n=6)組:移植前1周注射含供體50μgimDex的混懸液1ml。通過對(duì)不同劑量的供體imDex延長(zhǎng)受體大鼠生存時(shí)間的比較,篩選出最佳劑量。再根據(jù)最佳劑量,重復(fù)大鼠小腸移植實(shí)驗(yàn)及分組:未處理組(n=6):移植前1周經(jīng)陰莖背靜脈注射1ml生理鹽水;最佳劑量組(n=6):移植前1周經(jīng)陰莖背靜脈注射含供體最佳劑量imDex混懸液1ml。移植術(shù)后當(dāng)未處理組出現(xiàn)移植排斥的表現(xiàn)是,收取各組大鼠的外周血、脾臟及移植小腸分析。ELISA法檢測(cè)各組受體大鼠血清細(xì)胞因子IL-2、IFN-γ、TNF-α及TGF-β含量,混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR)檢測(cè)各組受體大鼠脾臟T淋巴細(xì)胞增殖能力,并ELISA法檢測(cè)MLR上清細(xì)胞因子IL-10及IFN-γ含量。流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組受體大鼠脾臟T淋巴細(xì)胞中CD4+CD25+T細(xì)胞比例,實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)各組受體大鼠脾臟T淋巴細(xì)胞Foxp3mRNA表達(dá)。常規(guī)病理切片(HE染色)觀察各組移植小腸病理變化。 結(jié)果A、B、C、D及E組受體平均存活時(shí)間分別為(7.0±0.6)天、(7.3±1.0)天,(9.8±1.2)天,(14.5±1.0)天和(7.8±1.2)。C組(10μgimDex)較A組(未處理組)受體存活時(shí)間輕度升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05), D組(20μgimDex)受體存活時(shí)間顯著高于C組(P0.05),B組(1μgimDex)及E組(50μgimDex)受體存活時(shí)間較A組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。ELISA檢測(cè)顯示imDex(20μg)治療組血清促炎性細(xì)胞因子IL-2、IFN-γ及TNF-α較未處理組顯著降低,而抑炎性細(xì)胞因子TGF-β含量則顯著升高。MLR結(jié)果顯示imDex(20μg)治療組受體大鼠脾臟T淋巴細(xì)胞在同種異體抗原的刺激下增殖受到顯著抑制,促炎性細(xì)胞因子IFN-γ分泌較未處理組顯著降低,而抑炎性細(xì)胞因子IL-10分泌顯著升高。流式細(xì)胞儀及實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)imDex(20μg)治療組脾臟CD4+CD25+T細(xì)胞比例及Foxp3mRNA表達(dá)較未處理組顯著升高。移植后第7天陰性對(duì)照組病理為急性重度排斥反應(yīng)的表現(xiàn),造瘺口壞死,閉塞,而imDex(20μg)治療組為輕度排斥反應(yīng)的表現(xiàn),造瘺口粘膜紅潤(rùn),輕度水腫,分泌少許腸液。 結(jié)論ImDC分泌的imDex可抑制大鼠小腸移植后的急性排斥反應(yīng),降低了受體血清促炎性細(xì)胞因子的變化,延長(zhǎng)了受體存活時(shí)間。受體脾臟CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例升高,進(jìn)而抑制受體初始T淋巴細(xì)胞增殖可能是imDex誘導(dǎo)移植免疫耐受的機(jī)制之一。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R392

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2452571