【摘要】： 神經(jīng)肽Y(Neuropeptide Y NPY)是一種含有36個(gè)氨基酸的多肽,廣泛分布于中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng),參與攝食行為、心血管活動(dòng)、精神活動(dòng)和痛覺調(diào)制等生理功能的調(diào)節(jié)。除了上述功能以外,NPY還參與了哺乳動(dòng)物免疫功能的調(diào)節(jié),在一些自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展中起到了關(guān)鍵的作用。NPY通過六種不同的G蛋白偶聯(lián)受體亞型來發(fā)揮作用,包括Y1、Y2、Y3、Y4、Y5和Y6受體。研究表明,多種免疫細(xì)胞,包括T細(xì)胞、B細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞等能夠表達(dá)NPY及其受體,并且在炎性刺激如脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)的刺激下,巨噬細(xì)胞能夠分泌NPY。近年來的研究發(fā)現(xiàn),與正常巨噬細(xì)胞相比,Y1受體敲除的巨噬細(xì)胞給予LPS刺激后,分泌腫瘤壞死因子(Tumer necrosis factorα,TNF-α)的水平下降。正常巨噬細(xì)胞應(yīng)用Y1受體拮抗劑后給予LPS刺激后,TNF-α的分泌水平也出現(xiàn)下降。表明NPY可以通過Y1受體調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞TNF-α的產(chǎn)生。但其分子機(jī)制不清。 本課題以小鼠巨噬細(xì)胞株RAW264.7細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?研究NPY對(duì)巨噬細(xì)胞在LPS刺激下產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子TNF-α的影響,并且初步探討其可能的機(jī)制。 本實(shí)驗(yàn)通過半定量RT-PCR檢測(cè)了RAW264.7細(xì)胞株的Y1受體的mRNA水平;酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中的TNF-α含量;Western blot檢測(cè)NPY對(duì)RAW264.7細(xì)胞內(nèi)相關(guān)信號(hào)分子的激活程度。 研究工作取得的主要結(jié)果如下: 1.RAW264.7細(xì)胞的Y1受體的mRNA的表達(dá):通過RT-PCR檢測(cè)了RAW264.7細(xì)胞株的Y1受體的mRNA水平,發(fā)現(xiàn)RAW264.7細(xì)胞株有Y1受體mRNA表達(dá)。 2.NPY對(duì)RAW264.7細(xì)胞LPS引起的TNF-α產(chǎn)生的影響:10~(-8)M NPY和100ng/mlLPS共同處理RAW264.7細(xì)胞0.5h,4h后收集上清檢測(cè)TNF-α,發(fā)現(xiàn)NPY能夠顯著提高LPS引起的TNF-α產(chǎn)生;預(yù)先加入Y1受體的抑制劑PD160170能夠阻斷NPY的效應(yīng),說明NPY能夠通過Y1受體提高RAW264.7細(xì)胞在LPS刺激下TNF-α的產(chǎn)生。 3.NPY對(duì)RAW264.7細(xì)胞LPS引起的MAPKs激活的影響:10~(-8)M NPY和100ng/mlLPS共同處理RAW264.7細(xì)胞0-0.5h,裂解細(xì)胞,收集蛋白進(jìn)行Western blot分析,發(fā)現(xiàn)NPY能夠增強(qiáng)LPS引起的ERK的激活,而對(duì)JNK和p38的激活沒有影響,說明NPY可能通過增強(qiáng)LPS引起的ERK的激活來提高TNF-α的產(chǎn)生。 4.NPY對(duì)RAW264.7細(xì)胞PI3K和PKC激活的影響:10(-8)M NPY處理RAW264.7細(xì)胞0-10min,發(fā)現(xiàn)NPY能夠顯著提高PI3K p85的磷酸化,不能激活PKC,Y1受體拮抗劑可以阻斷此效應(yīng)。推測(cè)NPY可能通過激活PI3K通路來增強(qiáng)ERK的激活和TNF-α的產(chǎn)生。 5.NPY激活的PI3K通路對(duì)RAW264.7細(xì)胞LPS引起的TNF-α和ERK激活的作用:預(yù)先應(yīng)用1μM的PI3K通路阻滯劑wortmannin孵育細(xì)胞30min后,加入10~(-8)M NPY和100ng/ml LPS共同處理RAW264.7細(xì)胞0-30min,發(fā)現(xiàn)NPY增強(qiáng)LPS引起的ERK的激活的效應(yīng)沒有被阻斷,NPY提高RAW264.7細(xì)胞在LPS刺激下TNF-α的產(chǎn)生的效應(yīng)也不能被wortmannin阻斷。NPY快速激活的PI3K信號(hào)通路并不參與其對(duì)ERK的激活和TNF-α產(chǎn)生的正向調(diào)節(jié)作用,NPY/Y1可能通過其他信號(hào)分子來調(diào)控LPS引起的ERK激活,進(jìn)而調(diào)節(jié)TNF-α的產(chǎn)生。 總之,NPY通過Y1受體對(duì)RAW264.7細(xì)胞LPS引起的TNF-α產(chǎn)生存在正向調(diào)節(jié)作用,該作用可能是通過增強(qiáng)LPS引起的ERK激活實(shí)現(xiàn)的。 以往研究發(fā)現(xiàn),在不同的細(xì)胞中NPY能夠通過激活PKC或是PI3K通路來激活ERK信號(hào)通路。本課題研究發(fā)現(xiàn),NPY能夠快速激活PI3K通路,但NPY調(diào)節(jié)LPS引起的ERK的激活與NPY引起的PI3K通路的激活并不相關(guān),說明有可能存在別的分子參與此過程。我們前期的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)10~(-8)M的NPY能夠快速激發(fā)Y1受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用。有研究表明Y1受體在NPY的刺激下存在網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)型內(nèi)吞作用,而且快速內(nèi)吞過程中伴隨著β-arrestin 2的結(jié)合。β-arrestin 2作為連接分子能夠促進(jìn)Raf依賴的ERK激活,在今后的工作中,我們將研究Y1受體介導(dǎo)內(nèi)吞中的β-arrestin 2或是NPY/Y1下游的別的信號(hào)分子是否參與調(diào)節(jié)LPS引起的ERK激活過程。
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【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號(hào)】：R363

【共引文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 張麗麗;于梅;;四種神經(jīng)肽在軟體動(dòng)物中的研究現(xiàn)狀[J];生命科學(xué)儀器;2008年11期

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本文編號(hào)：2452142