【摘要】：應(yīng)用鴨源禽流感H9N2滅活抗原配合黏膜免疫佐劑CpG DNA(以下簡(jiǎn)稱CpG)和葡萄糖飲水免疫,研究鴨消化道局部(主要是咽和小腸)和全身免疫水平的變化。7日齡雛鴨125只隨機(jī)分為5組。10日齡時(shí),第1組應(yīng)用0.3 ml生理鹽水飲水；第2組應(yīng)用0.3 m1鴨源禽流感H9N2滅活抗原飲水免疫；第3組應(yīng)用0.3 ml鴨源禽流感H9N2滅活抗原配合葡萄糖飲水免疫；第4組應(yīng)用0.3 ml鴨源禽流感H9N2滅活抗原配合CpG飲水免疫；第5組應(yīng)用0.3 ml鴨源禽流感H9N2滅活抗原配合CpG和葡萄糖飲水免疫。14日齡時(shí)再進(jìn)行二次免疫。首次免疫后第3、5、7周宰殺動(dòng)物并取材。首先,通過(guò)檢測(cè)消化道中上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞(IEL)、肥大細(xì)胞數(shù)量和小腸黏膜細(xì)胞因子IL-2和IL-6水平來(lái)探討禽流感H9N2滅活抗原配合佐劑飲水免疫對(duì)鴨消化道局部細(xì)胞免疫的影響；通過(guò)檢測(cè)消化道IgA和IgG分泌細(xì)胞數(shù)量及特異性抗體水平來(lái)探討禽流感H9N2滅活抗原配合佐劑飲水免疫對(duì)消化道局部體液免疫的影響；然后,通過(guò)檢測(cè)血清中特異性IgA和IgG抗體及禽流感HI抗體水平來(lái)探討禽流感H9N2滅活抗原配合佐劑飲水免疫對(duì)全身免疫水平的影響；最后,通過(guò)攻毒試驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證禽流感H9N2滅活抗原配合佐劑飲水免疫后,鴨群對(duì)H9N2病毒攻擊的抵抗力及免疫對(duì)鴨從糞便中排出病毒的影響；通過(guò)混合感染試驗(yàn)來(lái)探討禽流感H9N2滅活抗原配合佐劑飲水免疫對(duì)混合感染的影響。結(jié)果如下： 1.鴨IgA和IgG的提純和兔抗鴨IgA和IgG高免血清的制備 本試驗(yàn)首先從膽汁和血清中分別提純鴨的IgA和IgG,然后通過(guò)Sephadex G200凝膠過(guò)濾和DEAE-SephadexA-52纖維素柱；最后經(jīng)SDS-PAGE電泳鑒定結(jié)果顯示,IgA and IgG的重鏈分子量分別為70000～72000和67000。輕鏈分子量相同,約為26000。純化的鴨IgA和IgG分別背部皮下接種兔,所得的抗血清經(jīng)雙向瓊擴(kuò)試驗(yàn)測(cè)定其效價(jià),證明兔抗鴨IgA和IgG血清中抗體水平均達(dá)到1：32。 2.禽流感H9N2滅活抗原飲水免疫對(duì)鴨消化道局部細(xì)胞免疫水平的影響 應(yīng)用HE染色法顯示小腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞,結(jié)果發(fā)現(xiàn)：應(yīng)用CpG或應(yīng)用CpG和葡萄糖配合禽流感H9N2滅活抗原飲水免疫雛鴨后小腸中IEL數(shù)量顯著增多(P0.05)；單獨(dú)應(yīng)用或用葡萄糖配合禽流感H9N2滅活抗原飲水免疫后IEL數(shù)量均無(wú)明顯變化。 應(yīng)用甲苯胺藍(lán)染色法顯示咽和小腸中肥大細(xì)胞,結(jié)果發(fā)現(xiàn)：應(yīng)用CpG或應(yīng)用CpG和葡萄糖配合禽流感H9N2滅活抗原飲水免疫雛鴨后,咽和小腸中肥大細(xì)胞數(shù)量顯著或極顯著增加(P0.05或P0.01)；而單獨(dú)應(yīng)用或用葡萄糖配合禽流感H9N2滅活抗原飲水免疫后肥大細(xì)胞數(shù)量均無(wú)明顯變化。 應(yīng)用放射免疫法測(cè)定小腸黏膜中細(xì)胞因子IL-2和IL-6的水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn)：應(yīng)用CpG或應(yīng)用CpG和葡萄糖配合禽流感H9N2滅活抗原飲水免疫鴨在免疫后小腸黏膜中IL-2和IL-6水平均極顯著增加(P0.01)；而單獨(dú)應(yīng)用或應(yīng)用葡萄糖配合禽流感H9N2滅活抗原飲水免疫的鴨IL-2和IL-6水平均無(wú)明顯變化。 以上三個(gè)試驗(yàn)結(jié)果表明,禽流感H9N2滅活抗原配合佐劑飲水免疫可有效誘導(dǎo)鴨消化道局部細(xì)胞免疫應(yīng)答。 3.禽流感H9N2滅活抗原飲水免疫對(duì)鴨消化道局部體液免疫水平的影響 應(yīng)用SPA-HRP間接染色法顯示咽和小腸中IgA和IgG分泌細(xì)胞,結(jié)果發(fā)現(xiàn)：應(yīng)用CpG或應(yīng)用CpG和葡萄糖配合禽流感H9N2滅活抗原飲水免疫雛鴨后咽和小腸中[gA和IgG分泌細(xì)胞面積顯著或極顯著增加(P0.05或P0.01))；而單獨(dú)應(yīng)用或應(yīng)用葡萄糖配合禽流感H9N2滅活抗原飲水免疫后小腸IgA和IgG分泌細(xì)胞面積均無(wú)明顯變化。 應(yīng)用間接ELISA方法檢測(cè)咽和小腸黏膜部位SIgA和IgG抗體水平,結(jié)果表明：應(yīng)用CpG或應(yīng)用CpG和葡萄糖配合禽流感H9N2滅活抗原飲水免疫后,鴨的咽和小腸中SIgA和IgG抗體水平極顯著增加(P0.01)；而單獨(dú)應(yīng)用或應(yīng)用葡萄糖配合禽流感H9N2滅活抗原飲水免疫的鴨SIgA和IgG抗體水平無(wú)明顯變化。 以上兩個(gè)試驗(yàn)結(jié)果表明,禽流感H9N2滅活抗原配合佐劑飲水免疫可誘導(dǎo)鴨消化道局部體液免疫應(yīng)答。 4.禽流感H9N2滅活抗原飲水免疫對(duì)鴨全身免疫水平的影響 應(yīng)用血凝抑制(HI)試驗(yàn)檢測(cè)血清中禽流感HI抗體水平,結(jié)果表明：首免后第3、5、6周,應(yīng)用CpG或應(yīng)用CpG和葡萄糖配合禽流感H9N2滅活抗原飲水免疫鴨血清中禽流感HI抗體水平顯著升高(p0.05)；而單獨(dú)應(yīng)用或應(yīng)用葡萄糖配合禽流感H9N2滅活抗原飲水免疫的鴨血清中禽流感HI抗體水平無(wú)明顯變化。 應(yīng)用間接ELISA方法檢測(cè)血清中禽流感特異性IgA和IgG抗體水平,結(jié)果表明：應(yīng)用CpG或應(yīng)用CpG和葡萄糖配合禽流感H9N2滅活抗原飲水免疫顯著提高了血清中禽流感特異性IgA(首免后2至6周)和IgG(首免后3至7周)抗體水平(P0.05)；而單獨(dú)應(yīng)用或用葡萄糖配合禽流感H9N2滅活抗原飲水免疫對(duì)鴨血清中禽流感特異性IgA和IgG抗體水平無(wú)明顯變化。 以上兩個(gè)指標(biāo)提示,禽流感滅活抗原配合佐劑飲水免疫能夠在一定程度上誘導(dǎo)全身免疫水平。 5.禽流感H9N2滅活抗原飲水免疫對(duì)鴨攻毒保護(hù)和病毒擴(kuò)散的影響 攻毒試驗(yàn)7日齡鴨30只隨機(jī)分為3組。第1組應(yīng)用生理鹽水飲水；第2組應(yīng)用禽流感H9N2滅活抗原飲水免疫；第3組應(yīng)用禽流感H9N2滅活抗原配合CpG和葡萄糖飲水免疫。首次免疫后第21天用禽流感H9N2病毒(ELD50為10832／O.1ml)口腔滴注攻擊,劑量為每只鴨2ml。攻毒后各組鴨均無(wú)臨床癥狀,剖檢時(shí)也無(wú)肉眼可見損傷。病毒分離結(jié)果發(fā)現(xiàn)：攻毒后第3天,應(yīng)用生理鹽水和單獨(dú)應(yīng)用禽流感H9N2滅活抗原飲水免疫組有部分鴨的樣品中分離到禽流感病毒,而未從應(yīng)用禽流感H9N2滅活抗原配合CpG和葡萄糖飲水免疫鴨體內(nèi)分離到病毒。結(jié)果提示應(yīng)用禽流感H9N2滅活抗原配合CpG和葡萄糖飲水免疫后,鴨群能夠在一定程度上抵抗H9N2病毒的攻擊。 病毒擴(kuò)散試驗(yàn)7日齡鴨24只,其中12只雛鴨應(yīng)用生理鹽水飲水,另12只雛鴨應(yīng)用鴨源禽流感H9N2滅活抗原配合CpG和葡萄糖飲水免疫,首次免疫后第21天分別取6只鴨用禽流感H9N2亞型病毒口腔滴注攻擊。攻毒后混合飼養(yǎng)。病毒分離結(jié)果顯示,分別與未免疫攻毒鴨和免疫后攻毒鴨混合飼養(yǎng)后,未免疫鴨的病毒分離陽(yáng)性鴨數(shù)要高于免疫鴨。結(jié)果表明,應(yīng)用禽流感H9N2滅活抗原配合CpG和葡萄糖飲水免疫后能減少病毒擴(kuò)散。
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【學(xué)位授予單位】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R392

【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 況世昌;AIV-HA1與CTB的融合蛋白在蘇云金芽胞桿菌表面的表達(dá)及其生物活性分析[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2012年

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本文編號(hào)：2450697