【摘要】： 噬菌體抗體庫技術(shù)是繼單克隆抗體制備技術(shù)后具有換代地位的抗體制備技術(shù),在功能蛋白的表達(dá)、疾病診斷和治療等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。生長抑素(SS)是由下丘腦分泌的一種神經(jīng)多肽,通過抑制生長激素釋放而抑制動物生長和泌乳,是重要的內(nèi)分泌激素。因此,建立SS免疫測定方法和免疫芯片技術(shù)對于研究動物生長和泌乳調(diào)控機(jī)制、開發(fā)促進(jìn)動物生長發(fā)育和泌乳的新技術(shù)等,均具有重要意義。迄今,國內(nèi)外關(guān)于小分子單鏈抗體的研究鮮見報道,至今無應(yīng)用噬菌體展示技術(shù)篩選生長抑素單鏈重組抗體的報道。 本研究取健康BALB/C小鼠脾臟和用偶聯(lián)牛血清白蛋白的SS免疫小鼠脾臟,分別提取總RNA,擴(kuò)增抗體輕鏈和重鏈可變區(qū)基因,組裝成單鏈抗體基因。借助噬菌體展示技術(shù),平行建立天然和免疫鼠源單鏈抗體庫。主要結(jié)果如下: 1.人工抗原的合成及免疫:將設(shè)計(jì)合成的生長抑素利用碳化二亞胺法與BSA偶聯(lián),制備人工抗原,免疫BalB/C小鼠,其抗血清效價最高可達(dá)1:2560。 2.抗體可變區(qū)基因的獲得及目的基因構(gòu)建:分別取未免疫的和抗血清效價較高的小鼠脾臟提取總RNA,用RT-PCR分別擴(kuò)增得到抗體重鏈可變區(qū)(V_H)和輕鏈可變區(qū)(V_L)基因,大小分別為360bp和340bp左右;純化回收的V_H與V_L基因在接近等摩爾濃度下連接。在免疫庫構(gòu)建中采用含有Linker接頭片段的引物,利用重疊延伸PCR法(SOE-PCR)將V_H與V_L基因片段拼接起來,再用帶有限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的引物擴(kuò)增出單鏈抗體(ScFv)基因片段;在天然庫構(gòu)建中采用不對稱PCR連接單鏈抗體(ScFv)基因片段,分別獲得大小約750bp的目的片段。結(jié)果表明,不對稱PCR連接方法的效率高于傳統(tǒng)的組裝方法。 3.ScFv噬菌體抗體庫構(gòu)建:ScFv基因純化后經(jīng)SfiI和NotI雙酶切,與同樣經(jīng)過雙酶切的載體pCANTAB5E連接,電穿孔法轉(zhuǎn)化大腸桿菌TG1感受態(tài)細(xì)胞,提取質(zhì)粒,經(jīng)PCR初步鑒定證明有外源片段插入且與目的片段一致。轉(zhuǎn)化菌經(jīng)輔助噬菌體M13K07超感染后,收集上清,得到噬菌體抗體庫。天然庫的構(gòu)建中,經(jīng)過40次電擊,獲得了9.8×10~7抗體庫,相對于免疫抗體庫的3條片段SOE連接法,5次電擊獲得的9.3×10~7抗體庫,后者的效率要高的多�？梢钥闯�,免疫抗體庫構(gòu)建的工作量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于天然庫。 該抗體庫的建立,為進(jìn)一步篩選和表達(dá)抗體、建立生長抑素放射免疫測定、酶免疫測定、免疫組化分析和免疫芯片等技術(shù)奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:Phage antibody library (phage antibody library) is an antibody preparation technique which has the status of substitution after the preparation of monoclonal antibodies. It has wide application prospects in the fields of functional protein expression, disease diagnosis and treatment, and so on. Somatostatin (SS) is a neuropeptide secreted by hypothalamus. Somatostatin is an important endocrine hormone which inhibits animal growth and lactation by inhibiting growth hormone release. Therefore, it is of great significance to establish SS immunoassays and immuno-chip technique to study the regulation mechanism of animal growth and lactation, and to develop new techniques to promote animal growth and lactation. Up to now, there have been few reports on the study of small scFv and no report on screening somatostatin scFv by phage display technique. In this study, the spleens of healthy BALB/C mice and the spleens of mice immunized with bovine serum albumin (SS) were used to extract the variable region genes of the light chain and heavy chain of the amplified antibodies, respectively, and to assemble the single chain antibody genes into the spleens. The phage display technique was used to construct the natural and immune mouse scFv library in parallel. The main results are as follows: 1. Synthesis and immunization of artificial antigen: the synthetic somatostatin was coupled with BSA by carbodiimide method to prepare artificial antigen and immunize BalB/C mice. The antiserum titer was up to 1? 2560. 2. Acquisition of variable region gene of antibody and construction of objective gene: total RNA, was extracted from spleen of mice with high titer of anti-serum and unimmunized mice. The heavy chain variable region (V / H) and light chain variable region (V / L) of the antibody were amplified by RT-PCR, and their sizes were about 360bp and 340bp, respectively. The purified V _ (H) and V ~ (?) L genes were linked to each other at the same molar concentration. In the construction of immune library, the primers containing Linker splice fragment were used to splice the V _ (?) H with V\ The scFv (ScFv) gene fragment was amplified by primer with restriction endonuclease site. In the construction of natural library, asymmetric PCR was used to ligate the single chain antibody (ScFv) gene fragment, and the target fragment of about 750bp was obtained respectively. The results show that the efficiency of asymmetric PCR connection method is higher than that of traditional assembly method. Construction of 3.ScFv phage antibody library: ScFv gene was purified and digested by SfiI and NotI, then ligated with vector pCANTAB5E, and transformed into E. coli TG1 competent cells by electroporation, then the plasmid was extracted. It was proved by PCR that the foreign fragment was inserted and consistent with the target fragment. After superinfection with assistant phage M13K07, phage antibody library was obtained by collecting supernatant of transformed bacteria. In the construction of natural reservoir, 9.8 脳 10 ~ 7 antibody library was obtained after 40 electric shocks. Compared with the three fragments SOE connection method of immune antibody library, the 9.3 脳 10 ~ 7 antibody library obtained by five electric shocks was much more efficient than that of immune antibody library. It can be seen that the workload of constructing immune antibody library is much lower than that of natural one. The establishment of the antibody library lays a foundation for further screening and expression of antibodies, establishment of somatostatin radioimmunoassay, enzyme immunoassay, immunohistochemical analysis and immuno-chip techniques.
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R392

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本文編號：2450000