【摘要】： 目的：構建分子嵌合造血干細胞,體外探討它對T細胞增殖能力的影響,為研究分子嵌合誘導移植免疫耐受奠定基礎。 方法：①采用RT-PCR方法獲取供體C57BL／6小鼠MHC-I基因H-2Db,通過雙酶切、定向克隆技術將H-2Db亞克隆入逆轉(zhuǎn)錄病毒表達質(zhì)粒pMSCVneo,通過Lipofectamine 2000與輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細胞以獲得攜帶H-2Db基因的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒。②應用淋巴細胞分離液密度梯度分離法分選受體BALB／c小鼠骨髓造血干細胞。③將攜帶H-2Db的逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染造血干細胞并優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件,同時設置未轉(zhuǎn)染組,轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組；以熒光實時定量PCR和流式細胞術分別在mRNA水平和蛋白水平檢測轉(zhuǎn)染后各組造血干細胞H-2Db表達情況。④受體BALB／c小鼠輸注造血干細胞后7天,取脾細胞做為反應細胞,與來自供體C57BL／6小鼠脾細胞的刺激細胞行單向混合淋巴細胞培養(yǎng),MTT法檢測各組T細胞增殖情況。 結(jié)果：①成功獲取H-2Db基因,構建的質(zhì)粒pMSCVneo-H-2Db經(jīng)限制性雙酶切檢測和測序分析,結(jié)果表明質(zhì)粒構建成功。②質(zhì)粒pMSCVneo-H-2Db經(jīng)包裝后,獲得了攜帶H-2Db基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒。③成功體外分選及培養(yǎng)受體BALB／c小鼠骨髓造血干細胞,經(jīng)流式細胞術檢測CD34陽性細胞可達(35.60±2.19)%。④與未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組相比,轉(zhuǎn)染構建質(zhì)粒組H-2Db基因mRNA水平和蛋白水平表達均顯著升高,差異有統(tǒng)計學意義(P0.01)；而未轉(zhuǎn)染組與轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組之間差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。⑤單向混合淋巴細胞培養(yǎng)顯示,轉(zhuǎn)染構建質(zhì)粒組刺激指數(shù)較未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組明顯降低(P0.01),差異有統(tǒng)計學意義；而未轉(zhuǎn)染組與轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組之間刺激指數(shù)差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。 結(jié)論：①淋巴細胞分離液密度梯度分離法可成功從小鼠骨髓細胞中分離造血干細胞。②攜帶H-2Db基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可高效穩(wěn)定轉(zhuǎn)染受體BALB／c小鼠骨髓造血干細胞,且感染后H-2Db基因可穩(wěn)定表達。③構建的分子嵌合造血干細胞模型可以顯著抑制T細胞增殖能力,為進一步研究分子嵌合誘導移植免疫耐受打下實驗基礎。
[Abstract]:Aim: to construct molecular chimeric hematopoietic stem cells and to explore its effect on T cell proliferation in vitro, so as to lay a foundation for the study of molecular chimerism induced transplantation immune tolerance. Methods: 1 MHC-I gene of donor C57BL/6 mice was obtained by RT-PCR method. H-2Db was subcloned into retrovirus expression plasmid pMSCVneo, by restriction endonuclease digestion and directed cloning technique. Recombinant retrovirus carrying H-2Db gene was obtained by co-transfection of Lipofectamine 2000 with helper plasmid 293T cells. (2) Bone marrow hematopoietic stem cells of recipient BALB/c mice were separated by density gradient separation of lymphocyte separation solution. 3. The retrovirus carrying H-2Db was transfected into hematopoietic stem cells and the transfection conditions were optimized. At the same time, the non-transfected group was transfected into empty plasmid group. The expression of H-2Db in hematopoietic stem cells was detected at mRNA level and protein level by fluorescence real-time quantitative PCR and flow cytometry, respectively. Spleen cells were taken as response cells 7 days after infusion of hematopoietic stem cells in 4-receptor BALB/c mice. One-way mixed lymphocyte culture was performed with stimulated cells from donor C57BL/6 mouse spleen cells. The proliferation of T cells in each group was detected by MTT method. Results: 1 the H-2Db gene was successfully obtained, and the constructed plasmid pMSCVneo-H-2Db was detected by restriction double enzyme digestion and sequenced. The results showed that the plasmid was constructed successfully. 2 after packaging, the plasmid pMSCVneo-H-2Db was successfully constructed. The retrovirus particles carrying H-2Db gene were obtained. 3. Bone marrow hematopoietic stem cells of recipient BALB/c mice were successfully isolated and cultured in vitro. The percentage of CD34 positive cells was (35.60 鹵2.19)% by flow cytometry. 4 compared with the untransfected group and the transfected empty plasmid group, the expression of mRNA and protein of H-2Db gene in the transfected plasmid group was significantly higher than that in the control group. The difference was statistically significant (P0.01); There was no significant difference between the non-transfected group and the transfected empty plasmid group (P0.05). (5) the stimulation index of the transfected constructed plasmid group was significantly lower than that of the non-transfected group and the transfected empty plasmid group (P0.01), and there was no significant difference between the untransfected group and the transfected empty plasmid group (P0.05). The difference was statistically significant. There was no significant difference in stimulation index between the untransfected group and the transfected empty plasmid group (P0.05). Conclusion: 1Hematopoietic stem cells can be successfully isolated from mouse bone marrow cells by density gradient method of lymphocyte separation. 2 retroviral vector carrying H-2Db gene can efficiently and stably transfect hematopoietic stem cells into bone marrow stem cells of recipient BALB/c mice. 3 the molecular chimeric hematopoietic stem cell model could significantly inhibit the proliferation of T cells, which laid the experimental foundation for further study of molecular chimerism induced transplantation tolerance. 3. The expression of H-2Db gene was stable after infection. 3 the molecular chimeric hematopoietic stem cell model could significantly inhibit the proliferation of T cells.
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R-332;R392

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