【摘要】： 肝移植已成為各種良性終末期肝病及早期、中期肝癌有效的治療方法,然而,急性排斥反應(acute rejection,AR)仍是肝移植術后主要的并發(fā)癥之一。未成熟樹突狀細胞(immature dendritic cells,imDC)可誘導抗原特異性T細胞低反應性并延長移植器官的存活時間;但它可能在活體內(nèi)復雜的微環(huán)境中接受成熟信號而被誘導成熟,甚至會加重排斥反應。具有免疫抑制功能的單基因修飾imDC的基礎研究已證實可增強imDC誘導免疫耐受的能力,也表現(xiàn)出一定的局限性,未能達到理想的免疫耐受狀態(tài)。本研究采用聯(lián)合具有不同免疫抑制功能的雙基因共同修飾imDC,以進一步提高imDC誘導免疫耐受的能力,從而獲得受者的長期生存。 目的 聯(lián)合FasL和TGF-β1基因共修飾大鼠骨髓來源的imDC,旨在進一步提高imDC誘導大鼠同種異體原位肝移植免疫耐受的能力,以延長受鼠生存期。 方法 1.建立改良的大鼠原位肝移植模型:在原二袖套法的基礎上,采用快速切取供肝,一針法連續(xù)縫合肝上下腔靜脈以及對出血點進行熱止血等方法,進行120例大鼠原位肝移植,并觀察術后存活率。 2.建立大鼠原位肝移植急性排斥反應模型:大鼠原位肝移植分3種移植組合:SD→SD組(同基因對照組),SD→Wistar組及DA→Lewis組,每組合20例。分別于術后3、5、7和10 d各隨機處死4只,觀察外周血肝功能變化(ALT和TBIL)與肝臟病理改變,各組除外技術死亡的受鼠,將余受鼠留做生存分析。 3.培養(yǎng)和誘導DA大鼠骨髓來源的DC,經(jīng)形態(tài)學、免疫表型及功能鑒定確認后,將構建好的pIRES2-EGFP-hFasL和pIRES2-EGFP-hTGF-β1質粒共轉染到imDC,檢測hFasL和hTGF-β1的表達。 4.將空載體轉染的DA大鼠imDC分別從尾靜脈注射(尾靜脈注射組,20只)和腹腔注射(腹腔注射組,20只)至Lewis大鼠體內(nèi),兩組分別于注射后第1d、2d、3d、5d及7d各時間點處死4只大鼠,取胸腺、脾臟、腹腔淋巴結、肝臟及腎臟組織行冰凍切片,于熒光顯微鏡下觀察、計數(shù)并分析。 5.行以DA大鼠為供體、近交系Lewis大鼠為受體的同種異體原位肝移植140例,隨機均分為7組:未注射DC組(對照組)、mDC組、imDC組、空載體組、FasL組、TGF組及共轉染組;分別于移植前5d每天給Lewis大鼠腹腔注射mDC、imDC、空載體轉染的imDC、hFasL修飾的imDC、hTGF-β1修飾的imDC、hFasL和hTGF-β1共修飾的imDC各2×106個,于肝移植術后3d、7d、10d各處死4只,觀察外周血肝功能變化(ALT和TBIL),肝臟病理改變,肝、脾及腹腔淋巴結凋亡情況,外周血清細胞因子情況,各組除去技術死亡的受鼠,將余下受鼠作生存分析,死亡時取肝臟行病理組織學檢查。 結果 1.大鼠原位肝移植各主要操作步驟手術中位時間:供體手術20 min,供肝修整3 min,肝上下腔靜脈吻合9 min,門靜脈重建3 min,無肝期15 min,肝下下腔靜脈重建3 min。手術成功率達96.7%,動物的3周存活率為94.2%。 2. SD→SD組大鼠原位肝移植術后僅有極少量的單核細胞浸潤,RAI評分0～3分,屬非確定型急性排斥反應(或無急性排斥反應);SD→Wistar組3只(75%,3/4)受鼠移植肝臟病變逐漸加重,到7d時RAI評分為5～7分,屬于中度的急性排斥反應,術后10d才出現(xiàn)重度的急性排斥反應;有1只(25%,1/4)大鼠移植肝臟急性排斥反應在10d時反而減輕,淋巴細胞的浸潤有所減少;DA→Lewis組3d后移植肝臟病變均迅速加重,RAI評分均為8～9分。經(jīng)各時間點多組秩和檢驗示:3d時,3組差異無統(tǒng)計學意義(P=0.173),其排斥反應無顯著差異;5、7和10d時,3組差異均有統(tǒng)計學意義(P=0.008、P=0.006和P=0.010),DA→Lewis組排斥反應均最明顯,SD→Wistar組次之,SD→SD組均最不明顯。SD→SD組血清ALT、TBIL濃度隨著時間延長,逐漸下降,10d已恢復正常;DA→Lewis組血清ALT、TBIL濃度術后隨著時間的延長,呈進行性升高;SD→Wistar組血清ALT、TBIL濃度隨著時間延長,升高相對較慢,10d時達到DA→Lewis組7d的水平(P=0.934,P=0.072)。SD→SD組可長期存活,不發(fā)生排斥反應;SD→Wistar組中位生存時間為16d,DA→Lewis組中位生存時間為8d,明顯短于SD→Wistar組(P=0.000)。 3.成功建立了體外大量培養(yǎng)、誘導及擴增大鼠骨髓來源DC的方法;經(jīng)相差倒置顯微鏡、透射電鏡、掃描電鏡及流式細胞儀鑒定,證實所培養(yǎng)細胞為DC。形態(tài)學結果顯示:DC形態(tài)不規(guī)則,細胞核大而偏位,細胞表面可見細長樹枝狀突起。免疫表型結果顯示:mDC和imDC表面均表達表面分子OX62,而共刺激分子CD86在imDC呈低表達,在mDC呈高表達�；旌狭馨图毎磻�(MLR)結果顯示:imDC刺激同種異體T淋巴細胞的能力明顯弱于mDC(P=0.005)。pIRES2-EGFP-hFasL和pIRES2-EGFP-hTGF-β1質粒經(jīng)基因測序顯示其序列與Pubmed基因庫的hFasL和hTGF-β1序列相符合;經(jīng)PCR鑒定示在846bp和339bp處有明顯的條帶。熒光顯微鏡觀察顯示pIRES2-EGFP-hFasL和pIRES2-EGFP-h TGF-β1質粒轉染imDC后可見綠色熒光。流式細胞儀檢測轉染后未影響其表面分子CD86和CD80的表達。轉染后MLR顯示,TGF組、FasL組及共轉染組的imDC對T細胞的增殖反應均弱于imDC組(P=0.006、0.002及0.000);共轉染組的增殖反應均明顯弱于TGF組和FasL組(P=0.010及P=0.030)。ELISA檢測TGF組和共轉染組的TGF-β1表達明顯高于其他組,但各組sFasL的表達差異無統(tǒng)計學意義。經(jīng)Westen-Blot檢測有FasL和TGF-β1蛋白表達。 4.供體骨髓來源的imDC在受體內(nèi)的移行及分布顯示:尾靜脈注射組,第1d肝臟內(nèi)imDC數(shù)量最多,達(92.2±4.2)個,其次是脾臟(32.6±7.6)個,腹腔淋巴結最少,只有(3.7±2.0)個,隨著時間延長,肝臟、脾臟及腹腔淋巴結的imDC數(shù)量均逐漸減少;胸腺的imDC數(shù)量逐漸增多,第5d最高,為(30.6±14.3)個。腹腔注射組計數(shù)顯示,腹腔淋巴結為第1d臟器含imDC數(shù)量最多的器官,達(40.7±4.0)個,第2d達高峰(64.4±17.8)個,以后逐漸遞減,在1d、2d、3d、5d均多于尾靜脈注射組,其P值分別為0.000,0.000,0.000,0.003。腹腔注射組第1d肝臟imDC數(shù)量處于第2位,達(24.6±5.0)個,并逐漸遞增,第5d達到峰值(33.6±15.5)個,在1d、2d、3d少于尾靜脈注射組,差異有統(tǒng)計學意義,P值分別為0.000、0.000、0.005。腹腔注射組脾臟呈逐漸遞增,第5d達峰值為(35.9±11.3)個,多于尾靜脈注射組(P=0.000)。第5d,腹腔注射組胸腺imDC數(shù)量少于尾靜脈注射組(P=0.001)。 5. hFasL和hTGF-β1基因共修飾imDC誘導大鼠肝移植免疫耐受研究:肝臟病理示共轉染組和TGF轉染組術后僅有較少量的單核細胞浸潤,RAI評分2～5分,屬非確定型急性排斥反應到輕度急性排斥反應,10d開始出現(xiàn)肝細胞再生,有少量的中性粒細胞浸潤。FasL組排斥反應為輕度到中度,7d時肝臟出現(xiàn)中性粒細胞浸潤,10d出現(xiàn)大量中性粒細胞浸潤致大量肝細胞破壞。經(jīng)Kruskal-Wallis H檢驗示,3d時,7組差異有統(tǒng)計學意義(P=0.020)但各組肝臟排斥反應均屬輕度,共轉染組和TGF組的排斥反應均輕于FasL組;7d時,7組差異有統(tǒng)計學意義(P=0.001),共轉染組排斥反應均輕于TGF組和FasL組;10d時,7組差異有統(tǒng)計學意義(P=0.001),共轉染組排斥反應輕于TGF組和FasL組,TGF組輕于FasL組。肝功能示共轉染組于7d時就已基本恢復正常,FasL組于7d時有所降低,但10d時反而升高, ALT及TBIL的濃度均高于共轉染組(P=0.000,P=0.028);TGF組到10d時,肝功能已恢復正常,ALT及TBIL的濃度均低于FasL組(P=0.000,P=0.025),但與共轉染組相比,差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。TUNEL顯示FasL組的肝、脾及腹腔淋巴結中淋巴細胞凋亡指數(shù)與共轉染組相比,差異均無統(tǒng)計學意義(P0.05),但多于TGF組,差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05)。ELISA檢測示,術后7d共轉染組和TGF組的血清IL-1、IL-10及IL-12與FasL組相比,差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05);但共轉染組和TGF組之間差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。FasL組中位生存期20d與imDC組(23d)差異無統(tǒng)計學意義(P=0.335),而TGF組延長受鼠生存時間有限(48d);只有共轉染組出現(xiàn)長期存活的受鼠(90d),均長于FasL組和TGF組(P=0.000,P=0.001)。 結論 1.經(jīng)改良的大鼠原位肝移植方法,手術時間短,成功率高,穩(wěn)定可靠,建立了比較穩(wěn)定的大鼠原位肝臟移植模型,適用于肝移植方面的基礎研究。 2.SD→Wistar組合的大鼠原位肝移植模型雖可產(chǎn)生急性排斥反應,但發(fā)展相對慢,且會出現(xiàn)自發(fā)性免疫耐受,因而并非肝移植急性排斥反應基礎研究理想的動物模型;DA→Lewis組合的大鼠原位肝移植術后肝臟病理改變、肝功能的變化及生存時間均符合臨床上肝移植術后急性排斥反應的特點,是研究肝移植急性排斥反應理想的動物模型。 3.本實驗能培養(yǎng)、誘導、擴增大量的DC。hFasL或hTGF-β1基因轉染均能夠獲得有效的表達,轉染后對imDC表型沒有明顯影響;可明顯降低imDC對同種異體T淋巴細胞的反應性。聯(lián)合FasL和TGF-β1基因轉染的imDC在體外誘導同種異體免疫耐受的能力強于FasL或TGF-β1單基因轉染。 4.腹腔注射時imDC在體內(nèi)的分布主要以主動遷移為主,速度相對慢,避免了尾靜脈注射時大量imDC快速分布在肝臟,以及切除受體肝臟時其內(nèi)的imDC丟失,該途徑適于肝移植免疫耐受的基礎研究。 5.imDC、hFasL或hTGF-β1單基因修飾imDC均未能誘導同種異體大鼠肝移植長期存活; hFasL和hTGF-β1共轉染的imDC誘導同種異體大鼠肝移植免疫耐受的能力顯著增強,顯著延長同種異體肝移植大鼠的生存期。
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【學位授予單位】：福建醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2008
【分類號】：R392.4;R657.3

【引證文獻】

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1 胡續(xù)光;南今娘;李洪秀;;中國肝移植后排斥反應研究的發(fā)展趨勢[J];中國組織工程研究;2012年31期

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本文編號：2441088