【摘要】： 肝移植已成為各種良性終末期肝病及早期、中期肝癌有效的治療方法,然而,急性排斥反應(yīng)(acute rejection,AR)仍是肝移植術(shù)后主要的并發(fā)癥之一。未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞(immature dendritic cells,imDC)可誘導(dǎo)抗原特異性T細(xì)胞低反應(yīng)性并延長(zhǎng)移植器官的存活時(shí)間;但它可能在活體內(nèi)復(fù)雜的微環(huán)境中接受成熟信號(hào)而被誘導(dǎo)成熟,甚至?xí)又嘏懦夥磻?yīng)。具有免疫抑制功能的單基因修飾imDC的基礎(chǔ)研究已證實(shí)可增強(qiáng)imDC誘導(dǎo)免疫耐受的能力,也表現(xiàn)出一定的局限性,未能達(dá)到理想的免疫耐受狀態(tài)。本研究采用聯(lián)合具有不同免疫抑制功能的雙基因共同修飾imDC,以進(jìn)一步提高imDC誘導(dǎo)免疫耐受的能力,從而獲得受者的長(zhǎng)期生存。 目的 聯(lián)合FasL和TGF-β1基因共修飾大鼠骨髓來(lái)源的imDC,旨在進(jìn)一步提高imDC誘導(dǎo)大鼠同種異體原位肝移植免疫耐受的能力,以延長(zhǎng)受鼠生存期。 方法 1.建立改良的大鼠原位肝移植模型:在原二袖套法的基礎(chǔ)上,采用快速切取供肝,一針?lè)ㄟB續(xù)縫合肝上下腔靜脈以及對(duì)出血點(diǎn)進(jìn)行熱止血等方法,進(jìn)行120例大鼠原位肝移植,并觀察術(shù)后存活率。 2.建立大鼠原位肝移植急性排斥反應(yīng)模型:大鼠原位肝移植分3種移植組合:SD→SD組(同基因?qū)φ战M),SD→Wistar組及DA→Lewis組,每組合20例。分別于術(shù)后3、5、7和10 d各隨機(jī)處死4只,觀察外周血肝功能變化(ALT和TBIL)與肝臟病理改變,各組除外技術(shù)死亡的受鼠,將余受鼠留做生存分析。 3.培養(yǎng)和誘導(dǎo)DA大鼠骨髓來(lái)源的DC,經(jīng)形態(tài)學(xué)、免疫表型及功能鑒定確認(rèn)后,將構(gòu)建好的pIRES2-EGFP-hFasL和pIRES2-EGFP-hTGF-β1質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到imDC,檢測(cè)hFasL和hTGF-β1的表達(dá)。 4.將空載體轉(zhuǎn)染的DA大鼠imDC分別從尾靜脈注射(尾靜脈注射組,20只)和腹腔注射(腹腔注射組,20只)至Lewis大鼠體內(nèi),兩組分別于注射后第1d、2d、3d、5d及7d各時(shí)間點(diǎn)處死4只大鼠,取胸腺、脾臟、腹腔淋巴結(jié)、肝臟及腎臟組織行冰凍切片,于熒光顯微鏡下觀察、計(jì)數(shù)并分析。 5.行以DA大鼠為供體、近交系Lewis大鼠為受體的同種異體原位肝移植140例,隨機(jī)均分為7組:未注射DC組(對(duì)照組)、mDC組、imDC組、空載體組、FasL組、TGF組及共轉(zhuǎn)染組;分別于移植前5d每天給Lewis大鼠腹腔注射mDC、imDC、空載體轉(zhuǎn)染的imDC、hFasL修飾的imDC、hTGF-β1修飾的imDC、hFasL和hTGF-β1共修飾的imDC各2×106個(gè),于肝移植術(shù)后3d、7d、10d各處死4只,觀察外周血肝功能變化(ALT和TBIL),肝臟病理改變,肝、脾及腹腔淋巴結(jié)凋亡情況,外周血清細(xì)胞因子情況,各組除去技術(shù)死亡的受鼠,將余下受鼠作生存分析,死亡時(shí)取肝臟行病理組織學(xué)檢查。 結(jié)果 1.大鼠原位肝移植各主要操作步驟手術(shù)中位時(shí)間:供體手術(shù)20 min,供肝修整3 min,肝上下腔靜脈吻合9 min,門(mén)靜脈重建3 min,無(wú)肝期15 min,肝下下腔靜脈重建3 min。手術(shù)成功率達(dá)96.7%,動(dòng)物的3周存活率為94.2%。 2. SD→SD組大鼠原位肝移植術(shù)后僅有極少量的單核細(xì)胞浸潤(rùn),RAI評(píng)分0～3分,屬非確定型急性排斥反應(yīng)(或無(wú)急性排斥反應(yīng));SD→Wistar組3只(75%,3/4)受鼠移植肝臟病變逐漸加重,到7d時(shí)RAI評(píng)分為5～7分,屬于中度的急性排斥反應(yīng),術(shù)后10d才出現(xiàn)重度的急性排斥反應(yīng);有1只(25%,1/4)大鼠移植肝臟急性排斥反應(yīng)在10d時(shí)反而減輕,淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn)有所減少;DA→Lewis組3d后移植肝臟病變均迅速加重,RAI評(píng)分均為8～9分。經(jīng)各時(shí)間點(diǎn)多組秩和檢驗(yàn)示:3d時(shí),3組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.173),其排斥反應(yīng)無(wú)顯著差異;5、7和10d時(shí),3組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.008、P=0.006和P=0.010),DA→Lewis組排斥反應(yīng)均最明顯,SD→Wistar組次之,SD→SD組均最不明顯。SD→SD組血清ALT、TBIL濃度隨著時(shí)間延長(zhǎng),逐漸下降,10d已恢復(fù)正常;DA→Lewis組血清ALT、TBIL濃度術(shù)后隨著時(shí)間的延長(zhǎng),呈進(jìn)行性升高;SD→Wistar組血清ALT、TBIL濃度隨著時(shí)間延長(zhǎng),升高相對(duì)較慢,10d時(shí)達(dá)到DA→Lewis組7d的水平(P=0.934,P=0.072)。SD→SD組可長(zhǎng)期存活,不發(fā)生排斥反應(yīng);SD→Wistar組中位生存時(shí)間為16d,DA→Lewis組中位生存時(shí)間為8d,明顯短于SD→Wistar組(P=0.000)。 3.成功建立了體外大量培養(yǎng)、誘導(dǎo)及擴(kuò)增大鼠骨髓來(lái)源DC的方法;經(jīng)相差倒置顯微鏡、透射電鏡、掃描電鏡及流式細(xì)胞儀鑒定,證實(shí)所培養(yǎng)細(xì)胞為DC。形態(tài)學(xué)結(jié)果顯示:DC形態(tài)不規(guī)則,細(xì)胞核大而偏位,細(xì)胞表面可見(jiàn)細(xì)長(zhǎng)樹(shù)枝狀突起。免疫表型結(jié)果顯示:mDC和imDC表面均表達(dá)表面分子OX62,而共刺激分子CD86在imDC呈低表達(dá),在mDC呈高表達(dá)�；旌狭馨图�(xì)胞反應(yīng)(MLR)結(jié)果顯示:imDC刺激同種異體T淋巴細(xì)胞的能力明顯弱于mDC(P=0.005)。pIRES2-EGFP-hFasL和pIRES2-EGFP-hTGF-β1質(zhì)粒經(jīng)基因測(cè)序顯示其序列與Pubmed基因庫(kù)的hFasL和hTGF-β1序列相符合;經(jīng)PCR鑒定示在846bp和339bp處有明顯的條帶。熒光顯微鏡觀察顯示pIRES2-EGFP-hFasL和pIRES2-EGFP-h TGF-β1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染imDC后可見(jiàn)綠色熒光。流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染后未影響其表面分子CD86和CD80的表達(dá)。轉(zhuǎn)染后MLR顯示,TGF組、FasL組及共轉(zhuǎn)染組的imDC對(duì)T細(xì)胞的增殖反應(yīng)均弱于imDC組(P=0.006、0.002及0.000);共轉(zhuǎn)染組的增殖反應(yīng)均明顯弱于TGF組和FasL組(P=0.010及P=0.030)。ELISA檢測(cè)TGF組和共轉(zhuǎn)染組的TGF-β1表達(dá)明顯高于其他組,但各組sFasL的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。經(jīng)Westen-Blot檢測(cè)有FasL和TGF-β1蛋白表達(dá)。 4.供體骨髓來(lái)源的imDC在受體內(nèi)的移行及分布顯示:尾靜脈注射組,第1d肝臟內(nèi)imDC數(shù)量最多,達(dá)(92.2±4.2)個(gè),其次是脾臟(32.6±7.6)個(gè),腹腔淋巴結(jié)最少,只有(3.7±2.0)個(gè),隨著時(shí)間延長(zhǎng),肝臟、脾臟及腹腔淋巴結(jié)的imDC數(shù)量均逐漸減少;胸腺的imDC數(shù)量逐漸增多,第5d最高,為(30.6±14.3)個(gè)。腹腔注射組計(jì)數(shù)顯示,腹腔淋巴結(jié)為第1d臟器含imDC數(shù)量最多的器官,達(dá)(40.7±4.0)個(gè),第2d達(dá)高峰(64.4±17.8)個(gè),以后逐漸遞減,在1d、2d、3d、5d均多于尾靜脈注射組,其P值分別為0.000,0.000,0.000,0.003。腹腔注射組第1d肝臟imDC數(shù)量處于第2位,達(dá)(24.6±5.0)個(gè),并逐漸遞增,第5d達(dá)到峰值(33.6±15.5)個(gè),在1d、2d、3d少于尾靜脈注射組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P值分別為0.000、0.000、0.005。腹腔注射組脾臟呈逐漸遞增,第5d達(dá)峰值為(35.9±11.3)個(gè),多于尾靜脈注射組(P=0.000)。第5d,腹腔注射組胸腺imDC數(shù)量少于尾靜脈注射組(P=0.001)。 5. hFasL和hTGF-β1基因共修飾imDC誘導(dǎo)大鼠肝移植免疫耐受研究:肝臟病理示共轉(zhuǎn)染組和TGF轉(zhuǎn)染組術(shù)后僅有較少量的單核細(xì)胞浸潤(rùn),RAI評(píng)分2～5分,屬非確定型急性排斥反應(yīng)到輕度急性排斥反應(yīng),10d開(kāi)始出現(xiàn)肝細(xì)胞再生,有少量的中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。FasL組排斥反應(yīng)為輕度到中度,7d時(shí)肝臟出現(xiàn)中性粒細(xì)胞浸潤(rùn),10d出現(xiàn)大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)致大量肝細(xì)胞破壞。經(jīng)Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)示,3d時(shí),7組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.020)但各組肝臟排斥反應(yīng)均屬輕度,共轉(zhuǎn)染組和TGF組的排斥反應(yīng)均輕于FasL組;7d時(shí),7組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001),共轉(zhuǎn)染組排斥反應(yīng)均輕于TGF組和FasL組;10d時(shí),7組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001),共轉(zhuǎn)染組排斥反應(yīng)輕于TGF組和FasL組,TGF組輕于FasL組。肝功能示共轉(zhuǎn)染組于7d時(shí)就已基本恢復(fù)正常,FasL組于7d時(shí)有所降低,但10d時(shí)反而升高, ALT及TBIL的濃度均高于共轉(zhuǎn)染組(P=0.000,P=0.028);TGF組到10d時(shí),肝功能已恢復(fù)正常,ALT及TBIL的濃度均低于FasL組(P=0.000,P=0.025),但與共轉(zhuǎn)染組相比,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。TUNEL顯示FasL組的肝、脾及腹腔淋巴結(jié)中淋巴細(xì)胞凋亡指數(shù)與共轉(zhuǎn)染組相比,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),但多于TGF組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。ELISA檢測(cè)示,術(shù)后7d共轉(zhuǎn)染組和TGF組的血清IL-1、IL-10及IL-12與FasL組相比,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);但共轉(zhuǎn)染組和TGF組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。FasL組中位生存期20d與imDC組(23d)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.335),而TGF組延長(zhǎng)受鼠生存時(shí)間有限(48d);只有共轉(zhuǎn)染組出現(xiàn)長(zhǎng)期存活的受鼠(90d),均長(zhǎng)于FasL組和TGF組(P=0.000,P=0.001)。 結(jié)論 1.經(jīng)改良的大鼠原位肝移植方法,手術(shù)時(shí)間短,成功率高,穩(wěn)定可靠,建立了比較穩(wěn)定的大鼠原位肝臟移植模型,適用于肝移植方面的基礎(chǔ)研究。 2.SD→Wistar組合的大鼠原位肝移植模型雖可產(chǎn)生急性排斥反應(yīng),但發(fā)展相對(duì)慢,且會(huì)出現(xiàn)自發(fā)性免疫耐受,因而并非肝移植急性排斥反應(yīng)基礎(chǔ)研究理想的動(dòng)物模型;DA→Lewis組合的大鼠原位肝移植術(shù)后肝臟病理改變、肝功能的變化及生存時(shí)間均符合臨床上肝移植術(shù)后急性排斥反應(yīng)的特點(diǎn),是研究肝移植急性排斥反應(yīng)理想的動(dòng)物模型。 3.本實(shí)驗(yàn)?zāi)芘囵B(yǎng)、誘導(dǎo)、擴(kuò)增大量的DC。hFasL或hTGF-β1基因轉(zhuǎn)染均能夠獲得有效的表達(dá),轉(zhuǎn)染后對(duì)imDC表型沒(méi)有明顯影響;可明顯降低imDC對(duì)同種異體T淋巴細(xì)胞的反應(yīng)性。聯(lián)合FasL和TGF-β1基因轉(zhuǎn)染的imDC在體外誘導(dǎo)同種異體免疫耐受的能力強(qiáng)于FasL或TGF-β1單基因轉(zhuǎn)染。 4.腹腔注射時(shí)imDC在體內(nèi)的分布主要以主動(dòng)遷移為主,速度相對(duì)慢,避免了尾靜脈注射時(shí)大量imDC快速分布在肝臟,以及切除受體肝臟時(shí)其內(nèi)的imDC丟失,該途徑適于肝移植免疫耐受的基礎(chǔ)研究。 5.imDC、hFasL或hTGF-β1單基因修飾imDC均未能誘導(dǎo)同種異體大鼠肝移植長(zhǎng)期存活; hFasL和hTGF-β1共轉(zhuǎn)染的imDC誘導(dǎo)同種異體大鼠肝移植免疫耐受的能力顯著增強(qiáng),顯著延長(zhǎng)同種異體肝移植大鼠的生存期。
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【學(xué)位授予單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類(lèi)號(hào)】：R392.4;R657.3

【引證文獻(xiàn)】

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1 胡續(xù)光;南今娘;李洪秀;;中國(guó)肝移植后排斥反應(yīng)研究的發(fā)展趨勢(shì)[J];中國(guó)組織工程研究;2012年31期

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本文編號(hào)：2441088