【摘要】： 結(jié)核病(Tuberculosis,TB)是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)所致以呼吸系統(tǒng)感染為主的慢性傳染病。目前全球有1/3的人口被MTB感染,其中約10%的感染者可能發(fā)生TB,而剩余的絕大多數(shù)感染者以潛伏感染形式存在。MTB潛伏感染(latent tuberculosis infection,LTBI)是一種亞臨床狀態(tài),此時細(xì)菌呈休眠狀態(tài)。由于潛伏感染人群大,范圍廣,不易診斷,是目前導(dǎo)致TB爆發(fā)的一個重要因素。 Hsp16.3(heat shock protein 16.3)是MTB的hspX基因(Rv2031c、acr)編碼的蛋白,很多研究認(rèn)為它的表達(dá)與MTB潛伏感染并形成休眠菌密切相關(guān)。研究表明Hsp16.3具有人和鼠的T淋巴細(xì)胞表位,是有效的亞單位疫苗的靶抗原。本研究旨在表達(dá)、純化得到Hsp16.3后,并輔助佐劑研究其在小鼠體內(nèi)誘發(fā)的免疫應(yīng)答水平和保護(hù)力,同時選擇Hsp16.3的T細(xì)胞表位合成肽作為對照,以期進(jìn)一步了解Hsp16.3的免疫學(xué)特性,為TB新型疫苗的研究提供實驗依據(jù),為探索MTB進(jìn)入休眠期和在休眠狀態(tài)下存活的機(jī)制研究奠定物質(zhì)基礎(chǔ),進(jìn)而對尋找抑制MTB進(jìn)入休眠期和殺滅MTB休眠菌的方法,對控制和根除TB具有重要意義。 1. Hsp16.3的表達(dá)和純化 以MTB毒株H37Rv的DNA為模板,根據(jù)Genbank公布的MTB全基因組設(shè)計引物進(jìn)行PCR,PCR產(chǎn)物核酸電泳鑒定后與經(jīng)同樣酶切的pTA2質(zhì)粒連接,進(jìn)行轉(zhuǎn)化并篩選出陽性克隆,雙向測序正確后命名為pTA2-Hsp16.3。將測序正確的Hsp16.3基因亞克隆入pPROEX HTb載體并誘導(dǎo)表達(dá)。分別用6×his的單克隆抗體(mAb)和Hsp16.3的mAb對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行Western blot分析,結(jié)果顯示在相對分子量約16 kDa處均有特異性條帶,與預(yù)計大小相吻合,表明成功表達(dá)目的蛋白。同時通過Western blot觀察到表達(dá)的Hsp16.3不能與活動期TB病人血清形成特異條帶。最后,采用Ni-NTA離子親和柱純化目的蛋白。 2. Hsp16.3和Hsp16.3合成肽的免疫學(xué)特性研究 選取BALB/c小鼠50只,隨機(jī)分為五組(每組10只),一組為Hsp16.3+二甲基雙十八烷酸銨(dimethyl dioctadecylammonium bromide,DDA)+單磷酸脂質(zhì)A(Monophosphoryl Lipid A,MPL)、一組為Hsp16.3合成肽+DDA+MPL,另一組為Hsp16.3合成肽+不完全弗氏佐劑(Freund’s Incomplete adjuvant, FIA),一共免疫3次,每次間隔2周,同時設(shè)生理鹽水組和BCG組作為對照。 在免疫過程中分別于0、2、4、6、8周采血,將血清1:500稀釋后,ELISA測血清中特異性抗體濃度,發(fā)現(xiàn)血清中抗Hsp16.3和抗Hsp16.3合成肽的抗體均呈迅速遞增趨勢,在免疫第4周后,增長趨于緩慢。末次免疫后4周,以Hsp16.3包被96孔板,測定各組平均抗體滴度,Hsp16.3+DDA+MPL組為1:3000,Hsp16.3合成肽+DDA+MPL組和Hsp16.3+FIA組均為1:1500,BCG組為1:500,生理鹽水組為1:100,3個實驗組的特異性抗體滴度顯著高于BCG組的(P 0.01);以Hsp16.3合成肽包被96孔板,測定各組平均抗體滴度,Hsp16.3+DDA+MPL組和Hsp16.3合成肽+DDA+MPL組為1:2000, Hsp16.3合成肽+FIA組為1:1000,BCG組為1:500,生理鹽水組為1:100,3個實驗組的特異性抗體滴度也顯著高于BCG組的(P 0.05)。 末次免疫4周后,分離每組5只免疫小鼠的脾淋巴細(xì)胞,用Hsp16.3和Hsp16.3合成肽分別進(jìn)行刺激,MTT法檢測淋巴細(xì)胞增殖,ELISA法檢測細(xì)胞因子IFN-γ的水平。結(jié)果顯示,Hsp16.3+DDA+MPL組、Hsp16.3合成肽+DDA+MPL組、Hsp16.3合成肽+FIA組小鼠的脾淋巴細(xì)胞經(jīng)Hsp16.3和Hsp16.3合成肽分別刺激后,其平均刺激指數(shù)均高于BCG組的(P 0.05),并顯著高于生理鹽水組的(P 0.01),表明3個實驗組小鼠脾淋巴細(xì)胞經(jīng)刺激后均能發(fā)生明顯的特異性增殖。當(dāng)用Hsp16.3刺激時,Hsp16.3+DDA+MPL組和Hsp16.3合成肽+DDA+MPL組的刺激指數(shù)高于Hsp16.3合成肽+FIA組(P 0.05);當(dāng)用Hsp16.3合成肽刺激時,Hsp16.3合成肽+DDA+MPL組大于Hsp16.3+DDA+MPL組的(P 0.05),Hsp16.3合成肽+DDA+MPL組和Hsp16.3合成肽+FIA組之間無差異(P 0.05)。 經(jīng)Hsp16.3和Hsp16.3合成肽分別刺激后, Hsp16.3+DDA+MPL組、Hsp16.3合成肽+DDA+MPL組和Hsp16.3合成肽+FIA組免疫小鼠的脾淋巴細(xì)胞誘生的IFN-γ水平均高于生理鹽水組的(P 0.01),但低于BCG組(P 0.01)。當(dāng)用Hsp16.3刺激時,3個實驗組的IFN-γ水平均無差異(P 0.05);而當(dāng)用Hsp16.3合成肽刺激時,Hsp16.3合成肽+DDA+MPL組的IFN-γ水平高于Hsp16.3+DDA+MPL組和Hsp16.3合成肽+FIA組的(P0.05)。 各組其余的5只免疫小鼠用MTB毒株H37Rv經(jīng)尾靜脈注射感染。4周后,脫頸處死小鼠,無菌條件下進(jìn)行脾臟勻漿,倍比稀釋后接種于7H10平板,37℃培養(yǎng)3～4周,計數(shù)細(xì)菌菌落形成單位(cloning forming units,CFU),以觀察免疫小鼠對MTB毒株攻擊的抵抗作用。結(jié)果表明,與生理鹽水組相比,3個實驗組和BCG組對MTB在脾臟中的增殖均有抵抗作用(P 0.05);但與BCG組相比,3個實驗組對MTB在脾臟中增殖的抵抗作用不如BCG組(P 0.05)。 3.結(jié)論 在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中成功表達(dá)并純化出Hsp16.3,該蛋白能夠與Hsp16.3的mAb發(fā)生特異性反應(yīng),表明具有一定的生物活性。免疫小鼠后的實驗結(jié)果顯示:Hsp16.3和Hsp16.3合成肽均能誘發(fā)的一定水平的細(xì)胞免疫應(yīng)答和體液免疫應(yīng)答,并產(chǎn)生一定的免疫保護(hù)力,可以抵御MTB的感染。Hsp16.3合成肽+DDA+MPL誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答水平和保護(hù)力均優(yōu)于Hsp16.3合成肽+FIA,表明佐劑的選擇對免疫結(jié)果有一定的影響,即DDA+MPL優(yōu)于FIA。與Hsp16.3合成肽相比,Hsp16.3誘導(dǎo)的體液免疫更強(qiáng)烈,但淋巴細(xì)胞增殖指數(shù),INF-γ釋放水平及對MTB毒株H37Rv的抵抗力均弱于其合成肽(差異不顯著)�？梢�,在一定免疫學(xué)共性的基礎(chǔ)上二者各有優(yōu)勢,提示Hsp16.3和Hsp16.3合成肽均有望成為TB疫苗的候選組分。
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【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R392

【參考文獻(xiàn)】

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