【摘要】： 目的： 通過用堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)和壓縮力刺激山羊骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells, BM-MSCs),用組織學(xué)、免疫組織化學(xué)和酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)檢測經(jīng)生物化學(xué)因子和生物力學(xué)刺激后的BM-MSCs產(chǎn)生的細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM),即Ⅰ型膠原和蛋白多糖,初步評價BM-MSCs做為顳下頜關(guān)節(jié)(Temporomandibular joint, TMJ)關(guān)節(jié)盤組織工程種子細(xì)胞的可行性,為進(jìn)一步進(jìn)行TMJ關(guān)節(jié)盤組織工程研究奠定基礎(chǔ)。 方法： 1、無菌條件下用18號骨髓穿刺針抽取1-3月齡剛剛宰殺的健康山羊股骨骨髓組織3-5ml, percoll淋巴細(xì)胞分離液分離培養(yǎng)。在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)變化及貼壁率,測定其生長曲線。 2、取生長狀態(tài)良好的P3, P4 BM-MSCs,用不同濃度的bFGF誘導(dǎo)培養(yǎng)液進(jìn)行誘導(dǎo),收集在7,14,21天的上清液進(jìn)行Ⅰ型膠原ELISA檢測,細(xì)胞爬片組織學(xué)和免疫組織化學(xué)染色。甲苯胺蘭和蕃紅O染色檢測糖胺聚糖(glycosmioglycan,GAG)、天狼猩紅和Ⅰ型膠原免疫組化檢測膠原,透射電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。 3、取生長狀態(tài)良好的P3, P4 BM-MSCs,用不同濃度的bFGF誘導(dǎo)培養(yǎng)液誘導(dǎo)2周,再用2%瓊脂糖包裹細(xì)胞,0-200KPa,0.1 Hz的壓縮力連續(xù)加載1周,每天2小時。加載后做冰凍切片,進(jìn)行組織學(xué)和免疫組織化學(xué)染色。甲苯胺蘭和蕃紅O染蛋白多糖、天狼猩紅和Ⅰ型膠原免疫組化檢測膠原。 結(jié)果： 1、原代培養(yǎng)的山羊BM-MSCs接種后24 h可觀察到貼壁細(xì)胞,大部分呈圓形、卵圓形,胞體較懸浮細(xì)胞大,部分細(xì)胞伸展變形,呈三角形,72h基本全部貼壁,大部分細(xì)胞為三角形和多角形,小部分為長梭形,可見細(xì)胞集落,第7-10天時細(xì)胞彼此相連,鋪滿瓶底,細(xì)胞以三角形為主,部分長梭形、多角形。傳代后12h貼壁率達(dá)90%,大部分為三角形,6-7d即可長滿瓶底。 2、細(xì)胞經(jīng)bFGF誘導(dǎo)培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)后,細(xì)胞增殖速度減慢,邊界清楚,大部分呈長三角形、梭形。甲苯胺藍(lán)、蕃紅O、天狼猩紅染色和Ⅰ型膠原免疫組化染色結(jié)果均呈陽性。超微結(jié)構(gòu)顯示細(xì)胞呈圓形或卵圓形,胞漿內(nèi)有豐富的線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基復(fù)合體,還有許多大小不等的溶酶體和核糖體,有的核糖體聚集成池。 3、BM-MSCs經(jīng)bFGF誘導(dǎo)和壓力加載后冰凍切片進(jìn)行甲苯胺藍(lán)、蕃紅O、天狼猩紅染色和Ⅰ型膠原免疫組化染色結(jié)果均呈陽性。 結(jié)論： BM-MSCs在體外培養(yǎng)增殖較快,且經(jīng)數(shù)代培養(yǎng)后仍能保持原有的細(xì)胞形態(tài),有種子細(xì)胞的生物學(xué)和形態(tài)學(xué)基礎(chǔ),在特定培養(yǎng)液誘導(dǎo)下能向軟骨細(xì)胞或成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化,表達(dá)TMJ關(guān)節(jié)盤相關(guān)的ECM,有望成為纖維軟骨組織工程較理想的種子細(xì)胞。
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【學(xué)位授予單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R329

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2437000