【摘要】： 目的： 通過用堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)和壓縮力刺激山羊骨髓間充質干細胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells, BM-MSCs),用組織學、免疫組織化學和酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)檢測經生物化學因子和生物力學刺激后的BM-MSCs產生的細胞外基質(extracellular matrix, ECM),即Ⅰ型膠原和蛋白多糖,初步評價BM-MSCs做為顳下頜關節(jié)(Temporomandibular joint, TMJ)關節(jié)盤組織工程種子細胞的可行性,為進一步進行TMJ關節(jié)盤組織工程研究奠定基礎。 方法： 1、無菌條件下用18號骨髓穿刺針抽取1-3月齡剛剛宰殺的健康山羊股骨骨髓組織3-5ml, percoll淋巴細胞分離液分離培養(yǎng)。在倒置相差顯微鏡下觀察細胞的形態(tài)變化及貼壁率,測定其生長曲線。 2、取生長狀態(tài)良好的P3, P4 BM-MSCs,用不同濃度的bFGF誘導培養(yǎng)液進行誘導,收集在7,14,21天的上清液進行Ⅰ型膠原ELISA檢測,細胞爬片組織學和免疫組織化學染色。甲苯胺蘭和蕃紅O染色檢測糖胺聚糖(glycosmioglycan,GAG)、天狼猩紅和Ⅰ型膠原免疫組化檢測膠原,透射電鏡觀察細胞超微結構。 3、取生長狀態(tài)良好的P3, P4 BM-MSCs,用不同濃度的bFGF誘導培養(yǎng)液誘導2周,再用2%瓊脂糖包裹細胞,0-200KPa,0.1 Hz的壓縮力連續(xù)加載1周,每天2小時。加載后做冰凍切片,進行組織學和免疫組織化學染色。甲苯胺蘭和蕃紅O染蛋白多糖、天狼猩紅和Ⅰ型膠原免疫組化檢測膠原。 結果： 1、原代培養(yǎng)的山羊BM-MSCs接種后24 h可觀察到貼壁細胞,大部分呈圓形、卵圓形,胞體較懸浮細胞大,部分細胞伸展變形,呈三角形,72h基本全部貼壁,大部分細胞為三角形和多角形,小部分為長梭形,可見細胞集落,第7-10天時細胞彼此相連,鋪滿瓶底,細胞以三角形為主,部分長梭形、多角形。傳代后12h貼壁率達90%,大部分為三角形,6-7d即可長滿瓶底。 2、細胞經bFGF誘導培養(yǎng)液進行培養(yǎng)后,細胞增殖速度減慢,邊界清楚,大部分呈長三角形、梭形。甲苯胺藍、蕃紅O、天狼猩紅染色和Ⅰ型膠原免疫組化染色結果均呈陽性。超微結構顯示細胞呈圓形或卵圓形,胞漿內有豐富的線粒體、粗面內質網、高爾基復合體,還有許多大小不等的溶酶體和核糖體,有的核糖體聚集成池。 3、BM-MSCs經bFGF誘導和壓力加載后冰凍切片進行甲苯胺藍、蕃紅O、天狼猩紅染色和Ⅰ型膠原免疫組化染色結果均呈陽性。 結論： BM-MSCs在體外培養(yǎng)增殖較快,且經數(shù)代培養(yǎng)后仍能保持原有的細胞形態(tài),有種子細胞的生物學和形態(tài)學基礎,在特定培養(yǎng)液誘導下能向軟骨細胞或成纖維細胞樣細胞表型轉化,表達TMJ關節(jié)盤相關的ECM,有望成為纖維軟骨組織工程較理想的種子細胞。
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【學位授予單位】：蘭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R329

【參考文獻】

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本文編號：2437000