【摘要】：目的 巨噬細(xì)胞是機(jī)體固有免疫系統(tǒng)的重要組成成分,但其組織分布、分化程度以及外界激活因子的多樣性賦予了巨噬細(xì)胞復(fù)雜的異質(zhì)性與功能的多樣性。在組織微環(huán)境中,巨噬細(xì)胞的激活會(huì)受到多種因素的影響。病原體的入侵、體內(nèi)壞死的細(xì)胞及碎片、其它細(xì)胞分泌的因子等刺激,均可使巨噬細(xì)胞的吞噬能力、細(xì)胞因子及趨化因子分泌能力、抗腫瘤能力、對(duì)趨化因子做出應(yīng)答以及對(duì)抗原的加工遞呈能力等發(fā)生明顯變化。本實(shí)驗(yàn)著重研究巨噬細(xì)胞對(duì)炎癥因子刺激發(fā)生的表型變化,明確IL-23對(duì)經(jīng)體外誘導(dǎo)建立的M2型骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞極化作用的影響。探討在IL-23作用下,表型發(fā)生變化后的M2型巨噬細(xì)胞對(duì)黑色素瘤細(xì)胞體外增殖和侵襲的影響,為以巨噬細(xì)胞再極化為靶點(diǎn)的腫瘤免疫治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)與新思路。 方法： 體外分離培養(yǎng)C57BL小鼠骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞,分別加入誘導(dǎo)因子IL-4、M-CSF和B16F10非接觸共培養(yǎng)建立三種M2型巨噬細(xì)胞模型,在此基礎(chǔ)上,觀察施加炎癥因子IL-23干擾后,三種M2型巨噬細(xì)胞形態(tài)、分泌因子、細(xì)胞代謝和細(xì)胞表面標(biāo)志物表達(dá)水平的變化：倒置顯微鏡下觀察在不同細(xì)胞因子刺激下,巨噬細(xì)胞形態(tài)變化；ELISA技術(shù)檢測(cè)三種M2型巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子表達(dá)情況,以及IL-23處理后分泌細(xì)胞因子表達(dá)水平的異同；Western blot技術(shù)檢測(cè)三種M2型巨噬細(xì)胞精氨酸代謝相關(guān)酶類(lèi)表達(dá)量,以及IL-23處理后表水平的變化；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)三種M2型巨噬細(xì)胞相關(guān)特異性細(xì)胞表面標(biāo)志物表達(dá)量,以及IL-23處理后表達(dá)水平的變化。MTT增殖實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)IL-23處理后的M2型巨噬細(xì)胞上清對(duì)黑色素瘤B16F10細(xì)胞增殖能力和侵襲能力的影響。MTT增殖實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)IL-23對(duì)黑色素瘤B16F10細(xì)胞增殖能力和侵襲能力的影響。 結(jié)果： 第一部分：IL-23對(duì)M2型巨噬細(xì)胞表型的影響。 三種M2型巨噬細(xì)胞模型經(jīng)一定濃度IL-23處理后,細(xì)胞形態(tài)由纖維梭形向煎蛋樣形態(tài)(M1型形態(tài))轉(zhuǎn)變；Elisa檢測(cè)IL-23處理后三種M2型巨噬細(xì)胞分泌因子變化,由IL-10highIL-12lowTNF-αlow轉(zhuǎn)變?yōu)镮L-10lowIL-12highTNF-αhigh; Western Blot顯示IL-23下調(diào)M2型巨噬細(xì)胞精氨酸酶(Arginase, Arg-1)的表達(dá),同時(shí)上調(diào)誘導(dǎo)性一氧化氮合酶(Inducible nitric-oxide synthase, iNOS)的表達(dá)(P0.01),精氨酸代謝向M1型方向轉(zhuǎn)化；流式細(xì)胞術(shù)分析顯示IL-23下調(diào)M2巨噬細(xì)胞特異表面標(biāo)志物CD206(P0.01),并上調(diào)CD16/32(P0.05)和MHC-Ⅱ(P0.01)的表達(dá)。綜上,經(jīng)IL-23處理后,三種M2型巨噬細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)、分泌因子種類(lèi)、細(xì)胞代謝和細(xì)胞表面標(biāo)志物表達(dá)水平均表明細(xì)胞已向M1型轉(zhuǎn)化,其是否對(duì)腫瘤細(xì)胞具有殺傷作用有待下一步研究。 第二部分：IL-23處理后M2型巨噬細(xì)胞對(duì)小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16F10體外增殖、侵襲能力的影響。 根據(jù)第一部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果,收集對(duì)照組M2型巨噬細(xì)胞和實(shí)驗(yàn)組(IL-23處理組)巨噬細(xì)胞上清,并設(shè)置單純血清為空白組檢測(cè)其對(duì)黑色素瘤細(xì)胞B16F10增殖的影響。改良Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其對(duì)黑色素瘤細(xì)胞B16F10侵襲能力的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：MTT細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)顯示與單純血清組相比,M2型巨噬細(xì)胞可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖,IL-23處理過(guò)后的M2型巨噬細(xì)胞上清抑制B16細(xì)胞增殖(P0.05),這一效應(yīng)與TNF-α的分泌相關(guān)；改良Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)顯示IL-23處理過(guò)后的M2型巨噬細(xì)胞與對(duì)照組相比,穿入下室細(xì)胞數(shù)顯著減少(P0.01)。提示IL-23在改變巨噬細(xì)胞表型的同時(shí),也恢復(fù)了M1型巨噬細(xì)胞的抗腫瘤免疫特性。 第三部分：IL-23對(duì)小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16F10體外增殖、侵襲的影響 多數(shù)細(xì)胞因子以自分泌形式發(fā)揮效應(yīng),即主要作用于產(chǎn)生細(xì)胞本身和(或)臨近細(xì)胞,在局部發(fā)揮效應(yīng)。其生物功能除參與免疫調(diào)節(jié)外,可直接作用于腫瘤細(xì)胞自身,調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖與侵襲。本部分選擇炎癥因子IL-23和黑色素瘤B16F10細(xì)胞進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)研究,通過(guò)培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞,施加IL-23影響,觀察其對(duì)B16F10細(xì)胞增殖、侵襲能力的直接作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：與對(duì)照組相比,IL-23處理組B16F10細(xì)胞穿膜數(shù)明顯增多(P0.01)；腫瘤細(xì)胞MMP-2和MMP-9的表達(dá)活性增強(qiáng)(P0.01)；B16細(xì)胞的增殖能力未見(jiàn)明顯變化。 結(jié)論 本研究通過(guò)體外建立三種M2型巨噬細(xì)胞模型,應(yīng)用Elisa、Western Blot、以及流式細(xì)胞術(shù)等技術(shù),觀察炎癥因子IL-23對(duì)其表型變化的影響,并通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)觀察轉(zhuǎn)變后巨噬細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的影響,主要結(jié)論如下： 1、IL-23可促進(jìn)M2巨噬細(xì)胞向M1型轉(zhuǎn)化,本實(shí)驗(yàn)中的具體表型為T(mén)NF-αhighIL-12highIL-10low, iNOS高表達(dá),CD16/32和MHC-Ⅱ表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞比例升高。 2、IL-23處理過(guò)后的M2型巨噬細(xì)胞可分泌具有細(xì)胞毒性的介質(zhì)(’TNF-α、NO等)抑制B16F10細(xì)胞的增殖,并在體外實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)為抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲。 3、IL-23對(duì)黑色素瘤B16F10細(xì)胞的增殖能力無(wú)影響,可通過(guò)上調(diào)MMP-9的活性促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲。
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【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：R392

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2433338