【摘要】： 研究背景 細(xì)胞是機(jī)體最基本的結(jié)構(gòu)和功能單位,在機(jī)體代謝過程中相互協(xié)調(diào),其中細(xì)胞凋亡(apoptosis)對于調(diào)節(jié)組織發(fā)育和內(nèi)穩(wěn)態(tài)有重要作用。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞死亡的一種形式,一種基本的生命現(xiàn)象,參與機(jī)體的生長發(fā)育及衰老等多種生理過程,同時也是參與包括腫瘤在內(nèi)的多種疾病的發(fā)病機(jī)制的重要因素。細(xì)胞凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及分子調(diào)控機(jī)制一直是生命科學(xué)研究領(lǐng)域包括腫瘤在內(nèi)的許多疾病發(fā)生發(fā)展過程中的一個非常重要的基本問題。雖然目前凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要途徑已經(jīng)明確,溶酶體是介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的重要結(jié)構(gòu),且在不同誘導(dǎo)因素引發(fā)凋亡時,其凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的途徑存在差異,但在多種誘因下溶酶體與線粒體之間凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的具體機(jī)制尚未明確。 本實驗是在前期研究的基礎(chǔ)上進(jìn)行的,既往我們發(fā)現(xiàn)氨基葡萄糖硫酸鹽(Glucosamine Sulfate,GS)可以誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡,并且這種凋亡是通過溶酶體途徑釋放Cathepsin D( Cat D)介導(dǎo)的,而且與Bcl-XL的下調(diào)相關(guān)聯(lián),但是Cat D信號是如何從溶酶體轉(zhuǎn)移到線粒體,與線粒體表面上的凋亡抑制蛋白Bcl-XL又有何種關(guān)系還不得而知。為明確在細(xì)胞凋亡中溶酶體釋放Cat D與線粒體外膜Bcl-XL有無相互作用的基礎(chǔ),Bcl-XL是否為溶酶體Cat D與線粒體間凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)新路徑的下游底物分子,我們進(jìn)行了它們的作用機(jī)制研究。 目的 建立氨基葡萄糖硫酸鹽(Glucosamine Sulfate,GS)誘導(dǎo)慢性髓性白血病(Chronic Myeloid Leukemia,CML) K562細(xì)胞凋亡的模型,用含5.0 mmol.L-1GS誘導(dǎo)K562細(xì)胞,應(yīng)用免疫熒光、Western Blot、RNA干擾等方法檢測溶酶體釋放的Cat D與線粒體外膜上Bcl-XL的變化,探討在K562細(xì)胞凋亡模型中,Cat D與Bcl-XL作用機(jī)制。 方法 1.慢性髓性白血病K562細(xì)胞凋亡前后,MTT法檢測細(xì)胞凋亡前后的細(xì)胞活性;凋亡前后K562細(xì)胞HE染色、Hoechst33342檢測細(xì)胞形態(tài)變化;應(yīng)用DNA ladder檢測細(xì)胞的凋亡情況;應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測誘導(dǎo)后細(xì)胞狀態(tài)。 2.應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡觀察免疫熒光雙標(biāo)記、Western blot方法檢測凋亡前后及應(yīng)用Pepstatin A抑制Cat D前后細(xì)胞內(nèi)的Cat D與Bcl-XL的相互作用機(jī)制。 3.購買的SANTA公司的特異性Cat D和Bcl-XL的小干擾RNA及陰性RNA。通過陽離子脂質(zhì)體將siRNAs分別轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞,倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)、免疫熒光雙標(biāo)染色后的激光共聚焦成像、反轉(zhuǎn)錄PCR檢測轉(zhuǎn)染后再用GS處理前后48h后Cat D和Bcl-XL mRNA表達(dá);利用免疫印跡技術(shù)測定細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNAs后,GS處理前后的Cat D和Bcl-XL的蛋白質(zhì)表達(dá)情況; 結(jié)果 1.0.5 mmol.L-1、1.0 mmol.L-1、5.0 mmol.L-1的GS誘導(dǎo)均有細(xì)胞抑制作用,5.0 mmol.L-1的GS抑制性最強(qiáng)。HE染色對照組K562細(xì)胞呈圓形,邊界光滑,胞膜無皺縮,而5.0 mmol.L-1 GS處理72 h后,細(xì)胞皺縮,胞膜不光滑,出現(xiàn)空泡現(xiàn)象并且細(xì)胞有出芽現(xiàn)象。5.0 mmol.L-1 GS處理72 h后Hoechst33342染色顯示出凋亡細(xì)胞存在。5.0 mmol.L-1 GS處理72 h后DNA ladder的電泳圖片上出現(xiàn)180-200bp明顯條帶;在流式細(xì)胞儀檢測中對照的K562細(xì)胞,也有少許凋亡,為腫瘤細(xì)胞的自發(fā)凋亡,而經(jīng)過5.0 mmol.L-1 GS誘導(dǎo)72 h后的K562細(xì)胞,凋亡明顯增多。與未處理的K562細(xì)胞相比5.0 mmol.L -1 GS誘導(dǎo)72 h后凋亡率由3.8 %變成12.4 % ,P0.05,。 2.經(jīng)過5.0 mmol.L-1 GS誘導(dǎo)72 h后的K562細(xì)胞,Cat D與Bcl-XL的激光共聚焦信號明顯增強(qiáng),Cathepsin D蛋白表達(dá)增加,而Bcl-XL蛋白表達(dá)減少。K562細(xì)胞經(jīng)用Pepstatin A處理,再用5.0 mmol.L-1 GS誘導(dǎo)72 h較GS處理組的Cat D的表達(dá)減弱,Cat D與Bcl-XL的共定位信號較處理前的信號明顯增強(qiáng),Cat D蛋白表達(dá)減少,而Bcl-XL蛋白表達(dá)則沒表現(xiàn)出明顯差異。 3.脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染干擾RNA后免疫熒光雙標(biāo)的激光共聚焦顯示:分別轉(zhuǎn)染Cat D siRNA和Bcl-XL siRNA組的K562細(xì)胞,被轉(zhuǎn)染抑制的信號在共定位的信號中明顯減弱。5.0 mmol.L-1 GS誘導(dǎo)72 h分別轉(zhuǎn)染Cat D siRNA和Bcl-XL siRNA組中,Cat D與Bcl-XL的共定位信號CatD相對增強(qiáng)。與轉(zhuǎn)染的K562細(xì)胞相比,GS誘導(dǎo)凋亡前后Cat D蛋白表達(dá)增加而Bcl-XL蛋白表達(dá)未見明顯差異。 結(jié)論 1.成功構(gòu)建氨基葡萄糖硫酸鹽誘導(dǎo)慢性髓性白血病的凋亡模型。5 mmol.L-1的GS誘導(dǎo)的K562細(xì)胞凋亡作用明顯; 2.5 mmol.L-1的GS誘導(dǎo)的凋亡細(xì)胞Cat D與Bcl-XL的共定位信號明顯增強(qiáng)。而Cat D蛋白表達(dá)增加,Bcl-XL蛋白表達(dá)減少。在Pepstatin A抑制Cat D后,再用5 mmol.L-1的GS誘導(dǎo)與單純的5 mmol.L-1的GS誘導(dǎo)的K562細(xì)胞,可以看出在Pepstatin A抑制后,Cat D與Bcl-XL的共定位信號中顯現(xiàn)Cat D的信號增強(qiáng)。Cat D蛋白表達(dá)減少,而Bcl-XL蛋白表達(dá)則沒表現(xiàn)出明顯差異。 3.脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染干擾RNA Cat D與Bcl-XL后兩者的共定位信號減弱。干擾Cat D后,Cat D與Bcl-XL的共定位信號表現(xiàn)為Cat D的表達(dá)減弱而Bcl-XL相對增強(qiáng);干擾Bcl-XL后,Cat D的表達(dá)相對增強(qiáng)。干擾Cat D與Bcl-XL前后兩者的蛋白表達(dá)均受抑制,而在5 mmol.L-1的GS誘導(dǎo)后,Cat D的表達(dá)增強(qiáng),而Bcl-XL則沒有明顯變化。
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【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R363

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2431064