【摘要】： 目的:在體外試驗(yàn)系統(tǒng),初步探討Cr(Ⅵ)在P53缺失且caspase抑制條件下誘導(dǎo)Hep3B細(xì)胞的凋亡機(jī)制,進(jìn)一步闡明ROS在其中的作用。 方法:以Hep3B細(xì)胞為受試細(xì)胞,通過(guò)MTT試驗(yàn)檢測(cè)不同濃度下Z-VAD-fmk、NAC、Cr(Ⅵ)對(duì)Hep3B細(xì)胞存活率的影響,通過(guò)單細(xì)胞凝膠電泳實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞凋亡形態(tài)篩選出有效的Cr(Ⅵ)作用時(shí)間。其后續(xù)試驗(yàn)Cr(Ⅵ)濃度定為20μmol/L,染毒時(shí)間為6h。將Hep3B細(xì)胞隨機(jī)分成對(duì)照組、Cr(Ⅵ)處理組、Z-VAD-fmk+Cr(Ⅵ)處理組、NAC+Cr(Ⅵ)處理組、Z-VAD-fmk+NAC+Cr(Ⅵ)處理組。Z-VAD-fmk和NAC分別預(yù)處理細(xì)胞1h,再加入K_2Cr_2O_7至終濃度20μmol/L,染毒6h。姬姆薩染色、電鏡觀察及單細(xì)胞凝膠電泳法觀察細(xì)胞凋亡形態(tài)及細(xì)胞DNA損傷情況,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率,熒光分光光度法檢測(cè)線粒體通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔(PTP)及跨膜電位(△ψm)、化學(xué)比色法檢測(cè)細(xì)胞氧化損傷。 結(jié)果: 1.Cr(Ⅵ)引起Hep3B細(xì)胞存活率降低:Cr(Ⅵ)在2.5-100μmol/L處理濃度范圍內(nèi),能明顯引起Hep3B細(xì)胞存活率的降低(P＜0.05),處理濃度和細(xì)胞存活率之間存在負(fù)相關(guān)(r=-0.893)。 2.染毒處理導(dǎo)致DNA損傷:與對(duì)照組相比,Cr(Ⅵ)、Z-VAD-fmk+Cr(Ⅵ)、NAC+Cr(Ⅵ)和Z-VAD-fmk+NAC+Cr(Ⅵ)處理組能明顯誘導(dǎo)細(xì)胞DNA鏈斷裂,彗星數(shù)量增多(P＜0.05);NAC+Cr(Ⅵ)、Z-VAD-fmk+NAC+Cr(Ⅵ)處理組,與Cr(Ⅵ)處理組相比DNA損傷程度減輕(P＜0.05)。 3.染毒處理對(duì)Hep3B細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響:Cr(Ⅵ)處理6h,引起Hep3B細(xì)胞皺縮或腫大,染色質(zhì)濃染,細(xì)胞間隙擴(kuò)大,空泡樣變,細(xì)胞膜和核膜不完整或消失,染色質(zhì)嗜堿性降低。電鏡下觀察,可發(fā)現(xiàn)Cr(Ⅵ)染毒組細(xì)胞出現(xiàn)表面微絨毛減少,線粒體腫脹、嵴消失、空泡狀變,細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)透亮區(qū)、呈空泡狀變等細(xì)胞凋亡或壞死的表現(xiàn)。加入NAC有保護(hù)作用。 4.染毒處理對(duì)Hep3B細(xì)胞凋亡的影響:與對(duì)照組相比,Cr(Ⅵ)、Z-VAD-fmk+Cr(Ⅵ)、NAC+Cr(Ⅵ)和Z-VAD-fmk+NAC+Cr(Ⅵ)處理組能明顯誘導(dǎo)Hep3B細(xì)胞細(xì)胞發(fā)生凋亡和壞死(P＜0.05);NAC有明顯保護(hù)作用(P＜0.05)。 5.染毒處理導(dǎo)致Hep3B細(xì)胞線粒體膜損傷:與對(duì)照組相比Cr(Ⅵ)、Z-VAD-fmk+Cr(Ⅵ)、NAC+Cr(Ⅵ)和Z-VAD-fmk+NAC+Cr(Ⅵ)處理組細(xì)胞線粒體膜電位(△ψm)降低,PTP開(kāi)放度增加,差異有顯著性(P＜0.05)。加入NAC后有明顯的拮抗作用(P＜0.05)。 6.染毒處理導(dǎo)致細(xì)胞氧化損傷:Cr(Ⅵ)、Z-VAD-fmk+Cr(Ⅵ)、NAC+Cr(Ⅵ)和Z-VAD-fmk+NAC+Cr(Ⅵ)染毒組引起SOD、CAT、GR活性明顯降低,NO、MDA生成增多,與對(duì)照組比較差異有顯著性(P＜0.05);加入NAC后有明顯保護(hù)作用(P＜0.05)。 結(jié)論:20μmol/L Cr(Ⅵ)能明顯引起Hep3B細(xì)胞氧化應(yīng)激,導(dǎo)致細(xì)胞DNA損傷、線粒體膜損傷、細(xì)胞凋亡等;同時(shí)在抑制caspase條件下,受試細(xì)胞仍然發(fā)生凋亡。結(jié)果提示,Cr(Ⅵ)誘導(dǎo)的凋亡可能存在非p53、非caspase途徑,其中ROS起重要作用。
[Abstract]:Aim: to investigate the mechanism of Cr (鈪，

本文編號(hào)：2430204