【摘要】： 背景：隨著近代生物技術(shù)的發(fā)展與人類(lèi)基因庫(kù)的不斷完善,人們?cè)诶碚撋虾蛯?shí)踐上的不斷探索,基因治療對(duì)許多疾病提供了一個(gè)新的治療途徑。所謂基因治療是指在基因水平上將有功能的基因或其他基因通過(guò)基因轉(zhuǎn)移方式導(dǎo)入患者體內(nèi),并使之表達(dá)正常的基因,或表達(dá)患者原來(lái)不存在或表達(dá)很低的外源基因�；蛑委煹幕緱l件包括：目的基因的獲取,靶細(xì)胞的選擇,將目的基因?qū)氚屑?xì)胞的方法和途徑。目前基因載體的主要分為兩類(lèi)：病毒載體或非病毒載體。非病毒載體具有的安全性,低免疫原性等優(yōu)勢(shì)成為研究的重點(diǎn)。其中如何將目的基因有效的轉(zhuǎn)運(yùn)到靶細(xì)胞或者靶部位是十分關(guān)鍵的步驟,基因槍作為純物理方式的非病毒轉(zhuǎn)染方法能夠方便、有效的轉(zhuǎn)運(yùn)基因,已經(jīng)越來(lái)越受到研究者的關(guān)注。 目的：合成葡聚糖-精胺陽(yáng)離子聚合物DSP,擴(kuò)增和提取質(zhì)粒DNApmcherry-c1和pEGFP-c3,研究以DSP為粘合劑制備基因槍子彈的方法,初步探討在同等條件下,用基因槍方法和普通轉(zhuǎn)染方法在體外的轉(zhuǎn)染能力比較,和用DSP作為粘合劑和用傳統(tǒng)亞精胺作為粘合劑進(jìn)行體外轉(zhuǎn)染能力的比較,以及用基因槍方法共轉(zhuǎn)染同單獨(dú)轉(zhuǎn)染能否發(fā)揮協(xié)同作用,提高轉(zhuǎn)染率的研究。 方法：研究首先以平均分子量為40KDa的葡聚糖作為反應(yīng)起始物,在室溫下經(jīng)高碘酸鉀氧化6個(gè)小時(shí),得到了氧化葡聚糖。通過(guò)鹽酸羥胺法測(cè)定了氧化葡聚糖醛基的含量,根據(jù)此含量按照1：1.25摩爾比的精胺與氧化葡聚糖反應(yīng),該反應(yīng)能生成含希夫氏堿的葡聚糖-精胺亞胺聚合物,所得到的聚合物在過(guò)量硼氫化鈉作用下,可還原生成穩(wěn)定葡聚糖—精胺共價(jià)陽(yáng)離子聚合物(DSP)。DSP通過(guò)FT-IR及1H-NMR其結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定,并用三硝基笨磺酸法(TNBS)測(cè)定其醛基的含量。 采用堿裂解法分別擴(kuò)增和提取了具有紅色熒光蛋白的質(zhì)粒pmcherry-c1和具有綠色熒光蛋白的質(zhì)粒pEGFP-c3。首先將質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)入到大腸桿菌中,增殖轉(zhuǎn)化的大腸桿菌擴(kuò)增質(zhì)粒DNA,然后采用堿裂解法從大腸桿菌中提取質(zhì)粒DNA并采用質(zhì)粒提取試劑盒除去其中的菌體殘片及內(nèi)毒素等進(jìn)行了純化。通過(guò)紫外分光光度計(jì)測(cè)量其濃度和純度,并用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行了鑒定。 制備了基因槍子彈,以DSP代替?zhèn)鹘y(tǒng)的亞精胺做為粘合劑制備基因槍子彈,以pmcherry-c1為報(bào)告基因,轟擊乳腺癌細(xì)胞(MCF-7),考察了基因槍轉(zhuǎn)染技術(shù)對(duì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率和細(xì)胞的生存率的影響,并采用了星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化了試驗(yàn)的條件,通過(guò)熒光倒置顯微鏡觀察細(xì)胞的轉(zhuǎn)染情況并計(jì)算轉(zhuǎn)染率；MTT法考察復(fù)合物細(xì)胞毒性,在同等條件下以亞精胺法制備了基因槍子彈作為對(duì)照。在此基礎(chǔ)上,研究了以DSP為粘合劑制備的基因槍子彈實(shí)現(xiàn)了兩種質(zhì)粒pmcherry-c1和PEGFP-c3的共轉(zhuǎn)染,以亞精胺法制備了基因槍共轉(zhuǎn)染子彈作為對(duì)照。 結(jié)果：所合成氧化葡聚糖醛基含量為7.27 mmol/g, DSP中接枝精胺的濃度為0.0214mg/ml。所提取的質(zhì)粒DNA的純度(比值在1.8-2.0之間)pmcherry-cl A260/A280=1.94, pEGFP-c3 A260/A280=1.92,其濃度分別Cpmcherry-c1= 492.8ug/ml, CpEGFP-c3=498.1ug/ml.用DSP為載體,用化學(xué)方法轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pmcherry-c1,得到轉(zhuǎn)染率為14.8%,細(xì)胞生存率為83.2%。用所合成的DSP代替?zhèn)鹘y(tǒng)的亞精胺作為粘合劑,以質(zhì)粒pmcherry-c1作為報(bào)告基因,制備了基因槍子彈,用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法,優(yōu)化了用基因槍法轉(zhuǎn)染體外MCF-7細(xì)胞轉(zhuǎn)染條件。其優(yōu)化條件為：每發(fā)子彈含鎢粉的量為1.0mg,質(zhì)粒DNA的量為1.2ug,基因槍的壓力為1.5kpa,轟擊距離2cm。得到的轉(zhuǎn)染效率為22.1%,細(xì)胞生存率為52.2%,同通過(guò)模型預(yù)測(cè)值的偏差的絕對(duì)值為8.3%,6.1%。同時(shí)在同等條件下,用傳統(tǒng)的亞精胺法制備了基因槍子彈作為對(duì)照,轟擊細(xì)胞后得到其轉(zhuǎn)染率為15.8%,細(xì)胞生存率為54.5%。研究了以DSP為粘合劑制備的基因槍子彈實(shí)現(xiàn)了2種質(zhì)粒pmcherry-c1和pEGFP-c3的共轉(zhuǎn)染,在每發(fā)子彈含鎢粉的量為1.0mg,質(zhì)粒DNA的量為1.2ug,基因槍的壓力為1.5kpa,轟擊距離2cm條件下,單獨(dú)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pmcherry-c1得到轉(zhuǎn)染率為21.0%,單獨(dú)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pEGFP-c3得到轉(zhuǎn)染率為19.9%,共同轉(zhuǎn)染這兩種質(zhì)粒DNA得到轉(zhuǎn)染率為23.0%,同時(shí),以同樣方法下以亞精胺法制備了基因槍,在同等條件下轉(zhuǎn)染細(xì)胞作為對(duì)照,單獨(dú)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pmcherry-c1得到轉(zhuǎn)染率為15.5%,單獨(dú)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pEGFP-c3得到轉(zhuǎn)染率為15.2%,共同轉(zhuǎn)染這兩種質(zhì)粒DNA得到轉(zhuǎn)染率為17.9%。 結(jié)論：該研究表明：用DSP制備的基因槍子彈比用DSP作為基因載體的化學(xué)方法體外細(xì)胞轉(zhuǎn)染有一定的提高,比用傳統(tǒng)的亞精胺法體外細(xì)胞轉(zhuǎn)染也有一定的提高,并且用DSP制備的共轉(zhuǎn)染比用傳統(tǒng)的亞精胺法制備的共轉(zhuǎn)染體外細(xì)胞轉(zhuǎn)染也有一定的提高。采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件,能夠很好的描述因素和效應(yīng)之間的關(guān)系,方法確實(shí)可行。所合成的葡聚糖-精胺陽(yáng)離子聚合物是一種制備工藝簡(jiǎn)單、低毒的高分子化合物,并可以代替亞精胺制備基因槍子彈。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類(lèi)號(hào)】：R341

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2428794