【摘要】： 皮膚干細胞存在于毛囊突起處,稱為毛囊干細胞,通過自我更新維持毛囊周期循環(huán)、表皮新陳代謝以及參與皮膚創(chuàng)傷愈合等。干細胞自我更新方式主要是通過不對稱分裂產(chǎn)生一個干細胞和短暫增殖細胞,能夠維持干細胞數(shù)目的穩(wěn)定,同時通過短暫增殖細胞的增殖和分化維持組織器官的新陳代謝。毛囊干細胞自我更新異常會導致皮膚腫瘤發(fā)生以及創(chuàng)傷愈合延遲等。目前對于毛囊干細胞穩(wěn)態(tài)維持的分子機制還知之甚少。 我們以前的研究顯示角質(zhì)細胞特異性敲除Smad4基因?qū)е滦∈蟀l(fā)生皮膚腫瘤。該小鼠是闡述Smad4基因與毛囊干細胞自我更新以及皮膚腫瘤發(fā)生的關(guān)系的良好動物模型。本研究中我們發(fā)現(xiàn)Smad4基因表達于正常靜息期的毛囊干細胞,提示Smad4在維持毛囊干細胞自我更新過程中可能發(fā)揮重要作用。LacZ染色顯示角蛋白5(keratin 5, K5)指導的Cre重組酶表達于毛囊干細胞并能夠介導Smad4基因在毛囊干細胞內(nèi)敲除。Smad4基因敲除小鼠表皮和毛囊角質(zhì)細胞增殖明顯加快,導致6月齡左右小鼠的表皮、毛囊和皮脂腺肥大,并且Smad4基因敲除小鼠在8月齡以前發(fā)生皮膚腫瘤。 那么Smad4基因敲除小鼠的皮膚腫瘤發(fā)生以及表皮肥大是否與毛囊干細胞的自我更新異常相關(guān)呢?我們利用干細胞代謝周期緩慢的特點,用溴代脫氧尿嘧啶核苷(bromodeoxyuridine,BrdU)標記滯留的方法來檢測毛囊干細胞:對出生后10天小鼠4次腹腔注射BrdU,使其能夠摻入到所有增殖細胞的基因組內(nèi),經(jīng)過2個月左右的間隔后檢測細胞內(nèi)的BrdU信號,此時體細胞由于細胞周期快已經(jīng)將BrdU代謝丟失,而毛囊干細胞細胞周期緩慢還保留有BrdU標記。在注射BrdU60天后進行檢測發(fā)現(xiàn),對照小鼠中BrdU標記滯留細胞(label retaining cells,LRCs)都集中在毛囊突起,而在Smad4基因敲除小鼠BrdU標記滯留細胞的范圍擴散到整個毛囊。同時用增殖性核抗原Ki67標記處于增殖期的細胞,在對照小鼠中,BrdU標記滯留的細胞Ki67絕大部分為陰性,說明正常的毛囊干細胞處于靜息狀態(tài);而在基因敲除小鼠中BrdU/Ki67雙陽性的細胞較對照小鼠明顯增多(11.2±5.0%比2.9±2.5%),提示Smad4基因敲除導致了毛囊干細胞的過度活化。毛囊干細胞開始增殖、細胞周期加快,標記的BrdU必然會較快的被代謝掉,將檢測BrdU的時間延長至標記后77天,發(fā)現(xiàn)在敲除小鼠毛囊已經(jīng)檢測不到BrdU信號,而對照小鼠依然保留有較強的BrdU信號,這印證了Smad4基因敲除導致了毛囊干細胞過度活化的觀點。 Smad4基因敲除小鼠毛囊干細胞的過度活化最終導致毛囊干細胞的分子標記物K15和CD34表達顯著降低。用CD34和α6-integrin抗體對毛囊干細胞進行流式分選,出生后72天Smad4基因敲除小鼠中干細胞數(shù)較對照小鼠顯著減少(2.0±1.3%比13.2±5.5%),提示Smad4基因敲除小鼠中干細胞過度活化導致毛囊干細胞的數(shù)目減少。 Smad4基因敲除小鼠中干細胞數(shù)目減少導致12月齡基因敲除小鼠的表皮和毛囊角質(zhì)細胞增殖速度劇烈下降,肥大的表皮、毛囊和皮脂腺逐漸萎縮。毛囊干細胞在創(chuàng)傷后被活化,通過產(chǎn)生短暫增殖性細胞快速向表皮層遷移參與創(chuàng)面的重上皮化。2月齡時Smad4基因敲除小鼠傷口邊緣增殖的角質(zhì)細胞數(shù)較對照小鼠明顯增多,而到了10月齡Smad4基因敲除小鼠傷口增殖的角質(zhì)細胞數(shù)較2月齡基因敲除小鼠顯著減少,這也印證了Smad4基因敲除小鼠中毛囊干細胞過度活化最終導致數(shù)目減少的觀點。 許多證據(jù)顯示皮膚腫瘤的發(fā)生與毛囊干細胞的關(guān)系密切。本研究中我們發(fā)現(xiàn)Smad4基因敲除小鼠導致毛囊干細胞過度活化,使增殖性細胞增多,導致8月齡以前Smad4基因敲除小鼠腫瘤的發(fā)生;然而毛囊干細胞以自我更新為代價,分裂產(chǎn)生過多的短暫增殖性細胞使干細胞數(shù)目減少,隨著短暫增殖性細胞的消耗,8月齡以后Smad4基因敲除小鼠幾乎沒有腫瘤發(fā)生。毛囊干細胞有分化成為多種子代細胞類型的潛能,例如表皮、毛囊和皮脂腺細胞,因而毛囊干細胞來源的腫瘤也表現(xiàn)出多樣性。與此相一致的是Smad4基因敲除小鼠發(fā)生多種類型的皮膚腫瘤包括鱗狀細胞癌、基底細胞癌、乳頭瘤和皮脂腺瘤。我們的實驗結(jié)果證明Smad4基因敲除通過使毛囊干細胞過度活化從而導致了皮膚腫瘤的發(fā)生。 Smad4基因敲除小鼠中活化型的β-catenin信號明顯增強與干細胞的過度活化相關(guān),而Pten的表達、Akt和GSK-3β磷酸化水平并沒有改變,說明β-catenin活化并不依賴于PI3K/Akt信號的過度激活。Smad4基因敲除導致c-Myc表達明顯升高,α6-integrin的表達降低,有可能通過改變毛囊干細胞的微環(huán)境,減弱了干細胞對其壁龕的黏附,使干細胞的自我更新異常,由通過不對稱分裂產(chǎn)生一個干細胞和一個短暫增殖性細胞轉(zhuǎn)變?yōu)榉只癁?個短暫增殖性細胞,促使毛囊干細胞過多的分化成為短暫增殖性細胞。 綜上所述,我們首次揭示了Smad4基因敲除引起毛囊干細胞過度活化,證明Smad4基因在維持毛囊干細胞正常自我更新中發(fā)揮非常重要的作用。
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【學位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2008
【分類號】：R329

【共引文獻】

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本文編號：2427936