【摘要】： 皮膚干細(xì)胞存在于毛囊突起處,稱為毛囊干細(xì)胞,通過自我更新維持毛囊周期循環(huán)、表皮新陳代謝以及參與皮膚創(chuàng)傷愈合等。干細(xì)胞自我更新方式主要是通過不對稱分裂產(chǎn)生一個干細(xì)胞和短暫增殖細(xì)胞,能夠維持干細(xì)胞數(shù)目的穩(wěn)定,同時通過短暫增殖細(xì)胞的增殖和分化維持組織器官的新陳代謝。毛囊干細(xì)胞自我更新異常會導(dǎo)致皮膚腫瘤發(fā)生以及創(chuàng)傷愈合延遲等。目前對于毛囊干細(xì)胞穩(wěn)態(tài)維持的分子機(jī)制還知之甚少。 我們以前的研究顯示角質(zhì)細(xì)胞特異性敲除Smad4基因?qū)е滦∈蟀l(fā)生皮膚腫瘤。該小鼠是闡述Smad4基因與毛囊干細(xì)胞自我更新以及皮膚腫瘤發(fā)生的關(guān)系的良好動物模型。本研究中我們發(fā)現(xiàn)Smad4基因表達(dá)于正常靜息期的毛囊干細(xì)胞,提示Smad4在維持毛囊干細(xì)胞自我更新過程中可能發(fā)揮重要作用。LacZ染色顯示角蛋白5(keratin 5, K5)指導(dǎo)的Cre重組酶表達(dá)于毛囊干細(xì)胞并能夠介導(dǎo)Smad4基因在毛囊干細(xì)胞內(nèi)敲除。Smad4基因敲除小鼠表皮和毛囊角質(zhì)細(xì)胞增殖明顯加快,導(dǎo)致6月齡左右小鼠的表皮、毛囊和皮脂腺肥大,并且Smad4基因敲除小鼠在8月齡以前發(fā)生皮膚腫瘤。 那么Smad4基因敲除小鼠的皮膚腫瘤發(fā)生以及表皮肥大是否與毛囊干細(xì)胞的自我更新異常相關(guān)呢?我們利用干細(xì)胞代謝周期緩慢的特點,用溴代脫氧尿嘧啶核苷(bromodeoxyuridine,BrdU)標(biāo)記滯留的方法來檢測毛囊干細(xì)胞:對出生后10天小鼠4次腹腔注射BrdU,使其能夠摻入到所有增殖細(xì)胞的基因組內(nèi),經(jīng)過2個月左右的間隔后檢測細(xì)胞內(nèi)的BrdU信號,此時體細(xì)胞由于細(xì)胞周期快已經(jīng)將BrdU代謝丟失,而毛囊干細(xì)胞細(xì)胞周期緩慢還保留有BrdU標(biāo)記。在注射BrdU60天后進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn),對照小鼠中BrdU標(biāo)記滯留細(xì)胞(label retaining cells,LRCs)都集中在毛囊突起,而在Smad4基因敲除小鼠BrdU標(biāo)記滯留細(xì)胞的范圍擴(kuò)散到整個毛囊。同時用增殖性核抗原Ki67標(biāo)記處于增殖期的細(xì)胞,在對照小鼠中,BrdU標(biāo)記滯留的細(xì)胞Ki67絕大部分為陰性,說明正常的毛囊干細(xì)胞處于靜息狀態(tài);而在基因敲除小鼠中BrdU/Ki67雙陽性的細(xì)胞較對照小鼠明顯增多(11.2±5.0%比2.9±2.5%),提示Smad4基因敲除導(dǎo)致了毛囊干細(xì)胞的過度活化。毛囊干細(xì)胞開始增殖、細(xì)胞周期加快,標(biāo)記的BrdU必然會較快的被代謝掉,將檢測BrdU的時間延長至標(biāo)記后77天,發(fā)現(xiàn)在敲除小鼠毛囊已經(jīng)檢測不到BrdU信號,而對照小鼠依然保留有較強(qiáng)的BrdU信號,這印證了Smad4基因敲除導(dǎo)致了毛囊干細(xì)胞過度活化的觀點。 Smad4基因敲除小鼠毛囊干細(xì)胞的過度活化最終導(dǎo)致毛囊干細(xì)胞的分子標(biāo)記物K15和CD34表達(dá)顯著降低。用CD34和α6-integrin抗體對毛囊干細(xì)胞進(jìn)行流式分選,出生后72天Smad4基因敲除小鼠中干細(xì)胞數(shù)較對照小鼠顯著減少(2.0±1.3%比13.2±5.5%),提示Smad4基因敲除小鼠中干細(xì)胞過度活化導(dǎo)致毛囊干細(xì)胞的數(shù)目減少。 Smad4基因敲除小鼠中干細(xì)胞數(shù)目減少導(dǎo)致12月齡基因敲除小鼠的表皮和毛囊角質(zhì)細(xì)胞增殖速度劇烈下降,肥大的表皮、毛囊和皮脂腺逐漸萎縮。毛囊干細(xì)胞在創(chuàng)傷后被活化,通過產(chǎn)生短暫增殖性細(xì)胞快速向表皮層遷移參與創(chuàng)面的重上皮化。2月齡時Smad4基因敲除小鼠傷口邊緣增殖的角質(zhì)細(xì)胞數(shù)較對照小鼠明顯增多,而到了10月齡Smad4基因敲除小鼠傷口增殖的角質(zhì)細(xì)胞數(shù)較2月齡基因敲除小鼠顯著減少,這也印證了Smad4基因敲除小鼠中毛囊干細(xì)胞過度活化最終導(dǎo)致數(shù)目減少的觀點。 許多證據(jù)顯示皮膚腫瘤的發(fā)生與毛囊干細(xì)胞的關(guān)系密切。本研究中我們發(fā)現(xiàn)Smad4基因敲除小鼠導(dǎo)致毛囊干細(xì)胞過度活化,使增殖性細(xì)胞增多,導(dǎo)致8月齡以前Smad4基因敲除小鼠腫瘤的發(fā)生;然而毛囊干細(xì)胞以自我更新為代價,分裂產(chǎn)生過多的短暫增殖性細(xì)胞使干細(xì)胞數(shù)目減少,隨著短暫增殖性細(xì)胞的消耗,8月齡以后Smad4基因敲除小鼠幾乎沒有腫瘤發(fā)生。毛囊干細(xì)胞有分化成為多種子代細(xì)胞類型的潛能,例如表皮、毛囊和皮脂腺細(xì)胞,因而毛囊干細(xì)胞來源的腫瘤也表現(xiàn)出多樣性。與此相一致的是Smad4基因敲除小鼠發(fā)生多種類型的皮膚腫瘤包括鱗狀細(xì)胞癌、基底細(xì)胞癌、乳頭瘤和皮脂腺瘤。我們的實驗結(jié)果證明Smad4基因敲除通過使毛囊干細(xì)胞過度活化從而導(dǎo)致了皮膚腫瘤的發(fā)生。 Smad4基因敲除小鼠中活化型的β-catenin信號明顯增強(qiáng)與干細(xì)胞的過度活化相關(guān),而Pten的表達(dá)、Akt和GSK-3β磷酸化水平并沒有改變,說明β-catenin活化并不依賴于PI3K/Akt信號的過度激活。Smad4基因敲除導(dǎo)致c-Myc表達(dá)明顯升高,α6-integrin的表達(dá)降低,有可能通過改變毛囊干細(xì)胞的微環(huán)境,減弱了干細(xì)胞對其壁龕的黏附,使干細(xì)胞的自我更新異常,由通過不對稱分裂產(chǎn)生一個干細(xì)胞和一個短暫增殖性細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榉只癁?個短暫增殖性細(xì)胞,促使毛囊干細(xì)胞過多的分化成為短暫增殖性細(xì)胞。 綜上所述,我們首次揭示了Smad4基因敲除引起毛囊干細(xì)胞過度活化,證明Smad4基因在維持毛囊干細(xì)胞正常自我更新中發(fā)揮非常重要的作用。
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【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R329

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：2427936