發(fā)布時間：2019-02-19 10:10

【摘要】： 造血功能障礙是惡性腫瘤化學(xué)藥物治療和大劑量放射線治療、放射源意外泄漏和核戰(zhàn)爭條件下急性放射損傷的主要并發(fā)癥之一。其中,巨核細(xì)胞損傷導(dǎo)致的血小板減少除輸注血小板外,尚缺乏有效的治療手段。血小板生成素(thrombopoietin,TPO)作為刺激巨核細(xì)胞增殖和血小板生成的重要細(xì)胞因子仍存在治療后產(chǎn)生抗凝血抗體、加重出血的危險性。如何安全有效地促進血小板數(shù)量和功能的恢復(fù),尚需探索。 造血微環(huán)境(hematopoietic inductive microenvironment,HIM)是支持和調(diào)節(jié)造血細(xì)胞生長發(fā)育的內(nèi)環(huán)境,具有促進巨核細(xì)胞增殖分化、成熟產(chǎn)板的作用。因此,從修復(fù)或重建骨髓造血微環(huán)境正常功能入手治療巨核細(xì)胞損傷,是一個值得探索的領(lǐng)域。 骨髓基質(zhì)細(xì)胞(human bone marrow stromal cells,hBMSCs)是造血微環(huán)境的主要成分,自1977年Dexter在體外培養(yǎng)出骨髓基質(zhì)細(xì)胞獲得成功后,人們對BMSCs進行了深入的研究。目前,骨髓基質(zhì)細(xì)胞體外培養(yǎng)擴增聯(lián)合造血干細(xì)胞回輸經(jīng)實驗和臨床驗證是重建造血功能損傷的有效方法。由于自體移植中患者自身造血微環(huán)境異常,而異體移植又存在組織相容性的問題,限制了骨髓基質(zhì)細(xì)胞在臨床上的廣泛運用。人臍血中的細(xì)胞成分豐富且較骨髓和外周血更原始,具有來源廣泛,采集方便,免疫原性弱和長期造血重建的特點,已成為新的造血干細(xì)胞來源。本課題組長期從事人臍血源基質(zhì)細(xì)胞(human umbilical cord blood-derived stromal cells,hUCBDSCs)及臍血造血微環(huán)境的研究,前期研究經(jīng)體外培養(yǎng)擴增獲得hUCBDSCs,證明其具備造血基質(zhì)細(xì)胞的基本特征和造血調(diào)控功能的物質(zhì)基礎(chǔ),以hUCBDSCs為滋養(yǎng)層的體外擴增體系促進巨核細(xì)胞集落(colony forming unit-megakaryocte,CFU-Meg)形成的作用明顯優(yōu)于hBMSCs,提示hUCBDSCs在促進巨核細(xì)胞增殖分化方面可能具有特殊的意義,對其作用特點和機制的深入研究可為巨核細(xì)胞損傷修復(fù)治療提供新的思路。 鑒于此,本課題在構(gòu)建巨核細(xì)胞/hUCBDSCs共培養(yǎng)模型和裸鼠造血微環(huán)境損傷模型的基礎(chǔ)上,觀察hUCBDSCs體外促進巨核細(xì)胞增殖和體內(nèi)重建造血微環(huán)境、促進巨核細(xì)胞生成和血小板數(shù)量恢復(fù)的作用。從TPO途徑、SDF-1途徑和間隙連接細(xì)胞間通`訊三個方面深入探討hUCBDSCs促進巨核細(xì)胞增殖和移植裸鼠血小板恢復(fù)的可能機制,為安全有效促進血小板功能和數(shù)量恢復(fù)提供新的輔助治療措施。 方法: 1.觀察人臍血源基質(zhì)細(xì)胞促進巨核細(xì)胞系HEL增殖的體外研究 實驗分組:①HEL細(xì)胞懸浮培養(yǎng)組;②HEL細(xì)胞/hBMSCs共培養(yǎng)組;③HEL細(xì)胞/hUCBDSCs共培養(yǎng)組。倒置顯微鏡和掃描電鏡觀察HEL細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞的位象關(guān)系;CCK8法繪制HEL細(xì)胞生長曲線;流式細(xì)胞儀檢測HEL細(xì)胞的細(xì)胞周期和凋亡壞死情況,透射電鏡觀察HEL細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。 2.觀察人臍血源基質(zhì)細(xì)胞移植重建造血微環(huán)境促進巨核細(xì)胞生成的在體研究 對裸鼠實施不同輻照劑量照射,觀察裸鼠輻照后不同時相點血象、骨髓象、CFU-F等指標(biāo)變化,探索適宜本研究的造血微環(huán)境損傷動物模型的輻照劑量。根據(jù)上述實驗結(jié)果,選定5.0Gy作為造血微環(huán)境損傷動物模型的輻照劑量;實驗分組:①生理鹽水組;②hBMSCs組;③hUCBDSCs組。觀察不同移植組造血微環(huán)境重建和巨核細(xì)胞、血小板數(shù)量恢復(fù)情況。動態(tài)觀察CM-DiI標(biāo)記hUCBDSCs裸鼠體內(nèi)遷移情況。 3.人臍血源基質(zhì)細(xì)胞促進巨核細(xì)胞增殖的機制研究 3.1 TPO途徑在人臍血源基質(zhì)細(xì)胞促進巨核細(xì)胞增殖中的作用 ELISA法動態(tài)檢測hBMSCs和hUCBDSCs培養(yǎng)上清TPO濃度;激光共聚焦、流式細(xì)胞儀檢測不同培養(yǎng)條件下HEL細(xì)胞C-mpl蛋白表達(dá),RT-PCR檢測HEL細(xì)胞C-mpl mRNA表達(dá)水平。 3.2 SDF-1途徑在人臍血源基質(zhì)細(xì)胞促進巨核細(xì)胞增殖中的作用 ELISA法動態(tài)檢測hBMSCs和hUCBDSCs培養(yǎng)上清SDF-1濃度;激光共聚焦、流式細(xì)胞儀檢測不同培養(yǎng)條件下HEL細(xì)胞CXCR4蛋白表達(dá),RT-PCR檢測HEL細(xì)胞CXCR4 mRNA表達(dá)水平。 3.3間隙連接細(xì)胞間通訊在人臍血源基質(zhì)細(xì)胞促進巨核細(xì)胞增殖中的作用 熒光漂白恢復(fù)(FRAP)技術(shù)檢測細(xì)胞間通訊功能;激光共聚焦顯微鏡觀察共培養(yǎng)條件下HEL細(xì)胞和hUCBDSCs Cx43蛋白表達(dá);RT-PCR法檢測共培養(yǎng)條件下HEL細(xì)胞和hUCBDSCs Cx43 mRNA水平表達(dá)情況。透射電鏡觀察共培養(yǎng)條件下HEL細(xì)胞和hUCBDSCs細(xì)胞連接處超微結(jié)構(gòu)。 結(jié)果: 1.倒置顯微鏡觀察,HEL細(xì)胞粘附在hUCBDSCs表面,呈球形,隨培養(yǎng)時間的延長,HEL細(xì)胞數(shù)量逐漸增多;掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)HEL細(xì)胞可通過偽足粘附于hUCBDSCs表層,或龕于hUCBDSCs融合所形成的“網(wǎng)眼”中,甚至移行到hUCBDSCs層下,部分hUCBDSCs胞膜突起與多個HEL細(xì)胞粘附,形成“放射狀”排列。HEL細(xì)胞生長曲線顯示HEL/hUCBDSCs組細(xì)胞生長速度最快;細(xì)胞周期結(jié)果顯示HEL/hUCBDSCs組S+G2/M期細(xì)胞比例最高(P0.05),突顯出hUCBDSCs在巨核細(xì)胞增殖中的特殊促進作用。凋亡率結(jié)果顯示三組之間無顯著性差異(p0.05)。 2.裸鼠接受不同劑量輻照所表現(xiàn)出來的血象變化程度不同,5.0Gy組裸鼠有明顯骨髓抑制和CFU-F計數(shù)降低,且在照射后自行恢復(fù),是裸鼠造血微環(huán)境損傷的理想輻照劑量。移植裸鼠實驗結(jié)果顯示:基質(zhì)細(xì)胞有明顯的促進血小板恢復(fù)的作用,其中hUCBDSCs作用最強。采用CM-DiI標(biāo)記hUCSDCs移植裸鼠,激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn):hUCSDCs在肝臟、脾臟和肺臟組織間隙短暫“停留”后,迅速“歸巢”至骨髓重建損傷造血微環(huán)境。 3.人臍血源基質(zhì)細(xì)胞促進巨核細(xì)胞增殖的機制研究 3.1 ELISA檢測結(jié)果顯示hUCBDSCs分泌表達(dá)TPO水平明顯高于hBMSCs,分泌高峰稍遲于hBMSCs,傳代后hUCBDSCs培養(yǎng)上清中的TPO濃度仍高于hBMSCs。流式細(xì)胞儀和激光共聚焦檢測均顯示其C-mpl蛋白的表達(dá)明顯增強;RT-PCR檢測不同培養(yǎng)條件下HEL細(xì)胞C-mpl mRNA表達(dá)情況,結(jié)果顯示無顯著性差異; 3.2 ELISA結(jié)果顯示:體外液體培養(yǎng)前6天,hUCBDSCs和hBMSCs SDF-1分泌水平相當(dāng),6天后hUCBDSCs SDF-1分泌水平明顯高于hBMSCs,傳代后hUCBDSCs培養(yǎng)上清中的SDF-1濃度仍高于hBMSCs;流式細(xì)胞儀和激光共聚焦檢測均顯示與hUCBDSCs和hBMSCs共培養(yǎng)的HEL細(xì)胞CXCR4蛋白表達(dá)明顯減弱,且可在部分HEL細(xì)胞胞漿中發(fā)現(xiàn)紅色點狀熒光;RT-PCR檢測不同培養(yǎng)條件下HEL細(xì)胞CXCR4 mRNA表達(dá)情況,結(jié)果顯示無顯著性差異; 3.3在本試驗條件下,熒光漂白恢復(fù)技術(shù)檢測結(jié)果提示hUCBDSCs和HEL細(xì)胞之間無明顯熒光物質(zhì)交換,而相互粘連的hUCBDSCs的熒光強度在淬滅后熒光迅速恢復(fù);激光共聚焦顯微鏡觀察共培養(yǎng)條件下HEL細(xì)胞Cx43表達(dá)較弱,呈均勻分布,hUCBDSCs Cx43表達(dá)較強,可見呈點狀群聚分布的高亮斑塊;RT-PCR檢測在HEL/hUCBDSCs共培養(yǎng)體系中,HEL細(xì)胞Cx43 mRNA的表達(dá)明顯低于hUCBDSCs。 結(jié)論: 1.人臍血源基質(zhì)細(xì)胞具有促進巨核細(xì)胞增殖的作用:①生長曲線  細(xì)胞擴增速度加快;②細(xì)胞周期  S+G2/M期細(xì)胞比例明顯增多;③掃描電鏡  可見hUCBDSCs粘附、龕合、包裹HEL細(xì)胞;④透射電鏡  可見大量增殖旺盛的HEL細(xì)胞和核分裂相; 2.人臍血源基質(zhì)細(xì)胞具有重建移植裸鼠造血微環(huán)境和促進巨核細(xì)胞和血小板數(shù)量和功能恢復(fù)的作用; 3. hUCBDSCs通過分泌高水平TPO,上調(diào)巨核細(xì)胞C-mpl蛋白的表達(dá),促進巨核細(xì)胞增殖、分化、產(chǎn)板; 4. hUCBDSCs通過分泌高水平SDF-1,促進巨核細(xì)胞的遷移和增殖,在遷移的過程中巨核細(xì)胞表面CXCR4表達(dá)降低,形成“內(nèi)吞小泡”,調(diào)控巨核細(xì)胞的遷移; 5.本試驗條件下,hUCBDSCs和HEL細(xì)胞間未檢測到間隙連接細(xì)胞間通訊,提示GJIC功能對hUCBDSCs促進巨核細(xì)胞增殖的作用不明顯。
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【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R329

【引證文獻】

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 馮一梅;高表達(dá)SDF-1人臍血源基質(zhì)細(xì)胞經(jīng)PECAM-1介導(dǎo)調(diào)控巨核細(xì)胞增殖遷移的機制研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2011年

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本文編號：2426406