【摘要】：睡眠受晝夜節(jié)律和內(nèi)穩(wěn)態(tài)因素的調(diào)控。腺苷是重要的內(nèi)源性促眠物質(zhì),腺苷受體(Receptor, R)有四種亞型：A1R、A2AR、A2BR和A3R,大量研究顯示：A1R和A2AR介導(dǎo)腺苷的促眠效應(yīng)。研究表明：腺苷可通過A1R抑制基底前腦膽堿能神經(jīng)元、結(jié)節(jié)乳頭體核(TMN)組胺能神經(jīng)元、和／或下丘腦外側(cè)部orexin能神經(jīng)元,促進睡眠。但全身或腦室內(nèi)給予A1R激動劑對睡眠覺醒周期無明顯影響；A1R基因剔除小鼠在基礎(chǔ)狀態(tài)和睡眠剝奪后,均無明顯的睡眠異常。因此我們推測,腺苷作用呈現(xiàn)腦區(qū)依賴性,可能激活某些腦區(qū)的A1R,抑制睡眠。下丘腦腹外側(cè)視前區(qū)(VLPO)是重要的睡眠中樞,我們推測激活VLPO區(qū)A1R可能抑制睡眠中樞,促進覺醒,抵消腦內(nèi)給藥抑制覺醒系統(tǒng)引起的睡眠。本研究利用高度自動化睡眠覺醒生物解析系統(tǒng),結(jié)合藥理學(xué)、免疫組織化學(xué)方法和A1R基因剔除小鼠,研究VLPO區(qū)A1R對自發(fā)性睡眠-覺醒及內(nèi)穩(wěn)態(tài)睡眠調(diào)節(jié)的作用及機制。 方法 1.利用高度自動化睡眠覺醒生物解析系統(tǒng),在VLPO區(qū)埋置導(dǎo)管,手術(shù)恢復(fù)后,通過局部微注射方式給藥,研究腺苷,A1R激動劑(CPA)、拮抗劑(CPT)及A2AR激動劑(CGS21680)、拮抗劑(MSX-3)對大鼠和小鼠基礎(chǔ)狀態(tài)下睡眠-覺醒行為的影響。 2.通過睡眠剝奪方式,結(jié)合腦電記錄及微注射方法,研究VLPO區(qū)A1R是否參與睡眠內(nèi)穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)。 3.通過Fos蛋白免疫組化染色方法,研究A1R在VLPO區(qū)對自發(fā)性睡眠-覺醒調(diào)節(jié)作用分子機制。 4.免疫組化染色方法,檢測不同睡眠張力下,VLPO區(qū)A1R的表達。 研究結(jié)果 基礎(chǔ)狀態(tài)下,腺苷A1R和A2AR在VLPO區(qū)對睡眠-覺醒的作用及分子機制研究 1.大鼠雙側(cè)VLPO區(qū)內(nèi)給予0.17、0.5或1.5nmol/side腺苷A1R激動劑CPA劑量依賴性地減少非快動眼(Non-rapid eye movement, Non-REM, NREM)和快動眼(REM)睡眠,促進覺醒,大劑量作用維持時間達2小時,且CPA能即刻產(chǎn)生促覺醒效應(yīng),并使動物在給藥后一個半小時內(nèi)處于完全覺醒狀態(tài),提示VLPO區(qū)A1R參與了覺醒的誘導(dǎo)。 2.大鼠VLPO區(qū)內(nèi)給予6、18.5或55pmol/side腺苷A1R拮抗劑CPT能顯著增加NREM睡眠,減少覺醒量,對REM睡眠有增加趨勢,但無統(tǒng)計學(xué)差異。不同劑量CPT促眠作用維持時間均為5小時。VLPO區(qū)給予55pmol/side CPT后,短時程NREM睡眠(持續(xù)時間64秒)出現(xiàn)次數(shù)增多,微小覺醒(持續(xù)時間16秒)增多,而長時程NREM睡眠和覺醒的出現(xiàn)次數(shù)并未發(fā)生變化,導(dǎo)致NREM睡眠及覺醒總的發(fā)生次數(shù)增加,覺醒平均持續(xù)時間縮短。NREM睡眠到覺醒,覺醒到NREM睡眠,以及REM睡眠到覺醒的轉(zhuǎn)換次數(shù)也分別增加。此外,NREM睡眠Delta波活動在0.75-3.25Hz頻率段增強,睡眠深度增加。生理狀態(tài)下阻斷VLPO區(qū)A1R后,睡眠量及深度均增加,且增加的睡眠呈現(xiàn)明顯的片段化,微小覺醒增多,提示動物維持覺醒困難,表明VLPO區(qū)內(nèi)A1R參與了生理性睡眠覺醒的調(diào)節(jié),并在覺醒維持中起重要作用。 3.野生型小鼠VLPO區(qū)內(nèi)給予0.3nmol/side CPA可以減少NREM和REM睡眠,增加覺醒量,作用維持時間為1小時；而在A1R基因剔除小鼠則未能引起睡眠覺醒的改變,說明CPA對A1R的激動具有高度特異性。 4.大鼠VLPO區(qū)內(nèi)分別給予6、55或500pmol/side A2AR激動劑CGS21680能劑量依賴地增加NREN和REM睡眠,減少覺醒量。大劑量(500pmol/side)CGS21680促眠作用維持時間為5小時。VLPO區(qū)給予CGS21680(500pmol/side)后睡眠覺醒各參數(shù)變化情況如下：NREM和REM睡眠總發(fā)生次數(shù)增加,覺醒平均持續(xù)時間縮短。不同持續(xù)時間片段的NREM和REM睡眠(包括短時程和長時程)的發(fā)生次數(shù)均有不同程度的增加,而導(dǎo)致長時程覺醒片段的發(fā)生次數(shù)減少,短時程覺醒片段發(fā)生次數(shù)增加。除NREM睡眠到REM睡眠轉(zhuǎn)換次數(shù)增加外,其他各時相之間的轉(zhuǎn)換次數(shù)均未發(fā)生改變。NREM睡眠Delta頻率段的波譜能量強度沒有變化。這些結(jié)果表明激活VLPO區(qū)內(nèi)A2AR誘導(dǎo)的睡眠與生理性睡眠相似,提示VLPO區(qū)可作為臨床上治療某些睡眠障礙疾病的潛在靶位。 5.大鼠VLPO區(qū)內(nèi)分別給予5或10nmol/side A2AR拮抗劑MSX-3對睡眠覺醒特征無明顯影響,提示VLPO區(qū)A2AR在生理情況下不參與睡眠覺醒的調(diào)節(jié)。 6.大鼠VLPO區(qū)內(nèi)分別給予0.5、1.5或4.5nmol/side腺苷對睡眠覺醒特征無明顯影響,可能是由于腺苷同時激活了A1R和A2AR,二者作用相互抵消所致。 7.Fos蛋白免疫組化研究顯示:VLPO區(qū)給予CPA1.5nmol/side,腦內(nèi)藍斑(LC)、導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)腹外側(cè)部(VLPAG)、TMN活性增加,并在皮層有大量Fos蛋白表達。這些結(jié)果表明：生理情況下,VLPO區(qū)A1R的促覺醒作用,與覺醒核團LC、VLPAG和TMN有關(guān)。 8.熒光免疫染色表明：VLPO區(qū)有腺苷A1R表達,但表達水平較低；睡眠剝奪后,A1R表達水平增加,可能與防止動物睡眠剝奪后的過度睡眠有關(guān)。 睡眠剝奪后,VLPO區(qū)A1R對睡眠內(nèi)穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié) 6小時睡眠剝奪后,VLPO區(qū)給予溶劑或A1R激動劑1.5nmol/side CPA,發(fā)現(xiàn)與對照組相比,CPA能顯著減少奪眠之后的睡眠反彈,即減少NREM和REM睡眠,增加覺醒量,作用維持時間為2小時；NREM和REM睡眠入睡潛伏期延長；NREM睡眠delta波譜能量強度減弱,睡眠深度減低。反之,6小時睡眠剝奪后給予A1R拮抗劑55pmol/side CPT,與對照組相比,在給予CPT后第2小時,睡眠剝奪后的睡眠反彈量增加(NREM睡眠增加,而REM睡眠無明顯變化),覺醒量減少,提示VLPO區(qū)A1R在睡眠內(nèi)穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。由于睡眠剝奪后,VLPO區(qū)A1R表達水平增高,結(jié)合睡眠剝奪行為學(xué)數(shù)據(jù),我們認為,睡眠剝奪增加的A1R與防止過度睡眠有關(guān)。 小結(jié) 1.生理狀態(tài)下,VLPO區(qū)A1R參與覺醒的誘導(dǎo)和維持。 2.激活VLPO區(qū)A1R后,覺醒增加。覺醒相關(guān)腦區(qū)LC、VLPAG和TMN可能參與這一作用。 3. VLPO區(qū)A1R參與了睡眠內(nèi)穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié),防止睡眠剝奪后VLPO神經(jīng)元的過度活化,即防止過度睡眠。 4. VLPO區(qū)A2AR在生理情況下不參與睡眠覺醒的調(diào)節(jié)。 5. VLPO區(qū)有腺苷A1R受體的低水平表達,睡眠剝奪后表達水平升高。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R338.63

【共引文獻】

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本文編號：2423212