【摘要】： 目的:探討骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞利用特定的誘導(dǎo)劑體外誘導(dǎo)分化為表皮細(xì)胞的可能性及MSCs單獨或與必要的誘導(dǎo)劑組合移植修復(fù)皮膚創(chuàng)面缺損與重建表皮的實驗研究,為臨床應(yīng)用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療大面積燒傷等疾病提供實驗依據(jù)。 方法: 1.大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)的分離培養(yǎng)、擴(kuò)增與鑒定:取健康0.2kg左右Wistar大鼠一只,麻醉后在無菌的條件下取股骨和脛骨,剪斷骨骺端,用無血清DMEM培養(yǎng)基沖出骨髓腔中的細(xì)胞后,用淋巴細(xì)胞分離液(比重1.077g/ml)密度梯度離心法分離單個核細(xì)胞(MNC),以含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基洗滌2次,以1×105cells/cm2密度接種于培養(yǎng)瓶孵育。2天后半量換液,4天時完全換液,棄去未貼壁細(xì)胞,貼壁細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng),以后每2-3天換液1次,14天后當(dāng)細(xì)胞融合達(dá)80%左右時,用胰蛋白酶消化傳代。定期觀察細(xì)胞的生長情況,細(xì)胞傳至第4代后用流式細(xì)胞儀分析CD34、CD29、CD90、CD45的表達(dá)情況,從而鑒定間充質(zhì)干細(xì)胞。 2. MSCs誘導(dǎo)分化成表皮細(xì)胞及其鑒定:將第4代細(xì)胞按106的密度接種于6孔培養(yǎng)板中,用含20%的燒傷大鼠血清的DMEM-F12培養(yǎng)基孵育,每3-4天換液一次,當(dāng)細(xì)胞達(dá)到90%融合時,用胰蛋白酶消化傳代,于第14天用免疫細(xì)胞化學(xué)染色及流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞角蛋白(CK)陽性細(xì)胞即表皮細(xì)胞的表達(dá)情況。 3.動物移植實驗:動物模型制備及誘導(dǎo)后的MSCs與未經(jīng)誘導(dǎo)的MSCs回植選取24只健康Wistar大鼠,平均體重為200g,雌雄各半,分為三組,每組八只,即治療組A(經(jīng)誘導(dǎo)的MSCs組)、治療組B(未經(jīng)誘導(dǎo)的MSCs組)和對照組C(無MSCs移植組);大鼠背部正中線處,各制造直徑約為5cm的圓形全層皮膚缺損創(chuàng)面,立即以Ⅰ型膠原為載體,將BrdU標(biāo)記的自體MSCs及含有經(jīng)誘導(dǎo)的MSCs分別單次涂布到治療組A、B的創(chuàng)面上,而對照組C組僅在創(chuàng)面上涂布Ⅰ型膠原,各組創(chuàng)面上均敷凡士林紗布,然后采用打包法進(jìn)行縫合固定后單籠飼養(yǎng)。 4.創(chuàng)面觀察接種后,切觀察創(chuàng)面情況,于術(shù)后第14天將創(chuàng)面大小描印于無菌透明薄膜上,按公式計算創(chuàng)口收縮率,記錄治療組和對照組愈合時間。 創(chuàng)口收縮率( %) =閉合創(chuàng)面面積/原創(chuàng)面面積×100 % 5.病理學(xué)及免疫組織化學(xué)染色檢查于4周后選擇實驗動物,取創(chuàng)面中央直徑1cm范圍的皮膚,制成石蠟切片,用蘇木精-伊紅染色法(HE染色)染色,光鏡下觀察皮膚結(jié)構(gòu)。同時,連續(xù)切片,采用SABC免疫組化檢測。嚴(yán)格按博士德公司試劑盒說明書操作,二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色。鼠抗BrdU單克隆抗體(北京中衫金橋生物公司)工作濃度1∶100 ,二抗羊抗鼠抗體工作濃度1∶100。于顯微鏡下觀察染色結(jié)果,細(xì)胞核呈棕黃色的細(xì)胞為BrdU陽性細(xì)胞。 結(jié)果: 1. MSCs的分離培養(yǎng)、擴(kuò)增與鑒定:細(xì)胞接種4天后首次完全換液,棄去未貼壁的細(xì)胞,貼壁的細(xì)胞即為MSCs,此細(xì)胞形態(tài)長梭形,類似成纖維細(xì)胞,呈團(tuán)、簇狀分布。14天時細(xì)胞貼滿瓶底,此時呈魚群樣、漩渦狀、輻射狀或網(wǎng)狀排列。傳代后細(xì)胞增殖迅速,一般2-3天可傳一代。流式細(xì)胞術(shù)分析MSCs結(jié)果顯示,CD34表達(dá)率為2.65±0.56%、CD29表達(dá)率為96.87±2.54%、CD90表達(dá)率為90.37±3.55%、CD45表達(dá)率為1.62±0.16%。 2.表皮細(xì)胞的鑒定:經(jīng)20%的燒傷大鼠血清誘導(dǎo)MSCs14天后,用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞角蛋白(cytokeratin CK)陽性細(xì)胞即表皮細(xì)胞的表達(dá)率為7.22%,而未經(jīng)誘導(dǎo)的CK陽性細(xì)胞的表達(dá)率為0.23%。同時,按免疫組化方法染色,檢測胞漿呈棕黃色的CK陽性細(xì)胞即為表皮細(xì)胞。 3.創(chuàng)面觀察:術(shù)后兩組創(chuàng)面均較干燥,面積逐日縮小,無明顯感染征象.術(shù)后第14天治療組A創(chuàng)面平均收縮率為78.2%±9.8%、治療組B創(chuàng)面平均收縮率為79.1%±10.4%,對照組C創(chuàng)面平均收縮率為70.7%±10.2%,各兩組間(A組與C組、B組與C組)均有顯著性差異(P0.05),而兩治療組間(A組與B組)差距無顯著性(P0.05);創(chuàng)面平均愈合時間分別是治療組A為15.4%±0.9d,治療組B為16.0%±1.2d,對照組C為19.5±1.0d,各兩組間(A組與C組、B組與C組)均有顯著性差異(P0.05),而兩治療組間(A組與B組)無顯著性差異(P0.05)。 4. MSCs單獨或與誘導(dǎo)劑組合移植皮膚再生作用比較:(1)常規(guī)病理學(xué)觀察:在第4周三組再生皮膚病理切片中,治療A、B組再生皮膚附件明顯豐富,表皮細(xì)胞數(shù)目顯著增多,細(xì)胞層次增多,表皮層明顯增厚。(2)免疫組織化學(xué)染色結(jié)果:在第4周治療A、B組再生皮膚組織切片中均可見BrdU染色陽性細(xì)胞,陽性細(xì)胞多位于皮膚附件毛囊內(nèi)層上皮根鞘以及再生表皮的基底層、棘層,在形態(tài)學(xué)上此類細(xì)胞呈立方形或多邊形,與周圍表皮細(xì)胞無明顯差異,且可見其相鄰生長。 結(jié)論: 1.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)燒傷大鼠血清誘導(dǎo)后,可以向表皮細(xì)胞方向分化,說明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在特定誘導(dǎo)劑作用下,具有向外胚層組織細(xì)胞分化的潛能。 2.比較MSCs單獨移植組和與必要的誘導(dǎo)劑組合移植組,其皮膚創(chuàng)面在平均收縮率、平均愈合時間方面均無統(tǒng)計學(xué)差異。 3.無論是MSCs單獨移植還是與必要的誘導(dǎo)劑組合移植其皮膚的修復(fù)與再生情況都超過大鼠皮膚自然愈合,且不僅皮膚再生快,而且皮膚附件如毛囊等的再生也比對照組明顯改善,為臨床上MSCs用于移植治療大面積嚴(yán)重?zé)齻燃膊√峁┝藢嶒炓罁?jù)(即:既要有取材方便的皮源,又能使再生創(chuàng)面較快生長且接近正常皮膚功能)。
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【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R329

【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前2條

1 易正鑫;冷敷對小鼠臏腱炎癥的影響[D];沈陽大學(xué);2010年

2 徐義虎;骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞促進(jìn)皮膚創(chuàng)面上皮化的實驗研究[D];昆明醫(yī)學(xué)院;2011年

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本文編號：2422549