發(fā)布時間：2019-02-14 16:56

【摘要】： 目的：本實(shí)驗(yàn)擬利用核酸免疫的原理,構(gòu)建含有目的基因肝特異性F蛋白的核酸質(zhì)粒,并對其在體內(nèi)外的表達(dá)以及免疫后體內(nèi)的免疫反應(yīng)進(jìn)行研究,以確定構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒本身的質(zhì)量及其引起的免疫反應(yīng),為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。 1.pcDNA3.1-F質(zhì)粒在COS-7細(xì)胞中的表達(dá) 作為核酸免疫的真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-F是以pcDNA3.1(+)為構(gòu)建載體,插入可以表達(dá)出相應(yīng)蛋白的目的基因,并加入促進(jìn)表達(dá)的Kozak序列。目的蛋白的表達(dá)是核酸免疫起作用的前提,為驗(yàn)證其是否表達(dá),本實(shí)驗(yàn)擬將重組質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞,在蛋白質(zhì)水平觀察插入目的基因的表達(dá)情況。 2.pcDNA3.1-F質(zhì)粒的體內(nèi)表達(dá)及能否引起特異性免疫反應(yīng) 體外可以表達(dá)的重組質(zhì)粒注射入小鼠體內(nèi)后,是否也可以順利的進(jìn)入小鼠體細(xì)胞并得以表達(dá)是核酸免疫引起機(jī)體免疫反應(yīng)的前提。核酸免疫可以引起機(jī)體全面的免疫反應(yīng),包括體液免疫和細(xì)胞免疫。本實(shí)驗(yàn)使用真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA 3.1-F免疫,我們設(shè)想其至少可以引起機(jī)體內(nèi)的體液免疫產(chǎn)生抗肝特異性F蛋白的抗體。為了驗(yàn)證這一設(shè)想,我們一方面用pcDNA3.1-F免疫小鼠制備抗血清,一方面用原核表達(dá)的方法制備肝特異性F蛋白抗原,然后用間接酶聯(lián)免疫方法檢測血清中特異性抗體的水平。 方法：核酸免疫是近年來發(fā)展起來的一種新型免疫方法,核酸免疫不但能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生體液免疫反應(yīng),更重要的是能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的細(xì)胞免疫反應(yīng),它不需要制備大量抗原,只需將編碼抗原的cDNA克隆到真核表達(dá)載體上,用重組質(zhì)粒對動物進(jìn)行免疫,免疫動物即可產(chǎn)生針對該抗原的抗體。本研究利用核酸免疫的原理 1.用PCR的方法從重組質(zhì)粒PET-15b-F中擴(kuò)增出肝特異性F蛋白基因,并在引物的設(shè)計中加入了Kozak序列,將克隆基因與真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)同時進(jìn)行雙酶切后連接,構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-F,并對其進(jìn)行雙酶切及測序鑒定是否構(gòu)建準(zhǔn)確。 2.將構(gòu)建準(zhǔn)確的真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-F及空質(zhì)粒pcDNA3.1,瞬時轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞,并用Western-blot檢測其表達(dá)產(chǎn)物。 3.將Balb/c小鼠分為四組,生理鹽水注射組、空質(zhì)粒pcDNA3.1(+)、質(zhì)粒pcDNA 3.1-F、質(zhì)粒pcDNA3.1-F+F蛋白(第四次免疫),質(zhì)粒提取均為純化去內(nèi)毒素,按照分組分別肌肉注射免疫Balb/c小鼠,每隔兩周免疫一次,連續(xù)免疫四次,每次免疫前斷尾取血制備抗血清,用間接酶聯(lián)免疫方法對收集血清進(jìn)行檢測。 結(jié)果： 1.用PCR的方法從重組質(zhì)粒PET-15b-F中擴(kuò)增肝特異性F蛋白基因,與預(yù)期的F蛋白基因大小相符,F片段和空質(zhì)粒pcDNA3.1(+)雙酶切后連接,經(jīng)酶切及測序鑒定肝特異性F蛋白表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-F構(gòu)建準(zhǔn)確。 2.將構(gòu)建準(zhǔn)確的真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-F及空載體pcDNA3.1(+),瞬時脂質(zhì)轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞,Western-blot檢測,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明只有轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-F質(zhì)粒的COS-7細(xì)胞中有肝特異性F蛋白的表達(dá)。 3.間接酶聯(lián)免疫方法檢測各組抗體效價,生理鹽水組和空質(zhì)粒pcDNA 3.1 (+)組實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)無相關(guān)抗體的檢出,而免疫pcDNA3.1-F的小鼠獲得了特異性抗體。結(jié)果表明：pcDNA3.1-F質(zhì)粒能夠在動物體內(nèi)表達(dá),在肌肉注射免疫小鼠后,可以引起機(jī)體產(chǎn)生特異性的肝特異性F蛋白抗體。但在第四次免疫注射原核表達(dá)的肝特異性F蛋白組抗體效果水平明顯高于重組質(zhì)粒注射組,可見質(zhì)粒免疫抗體效價并不高,還有待進(jìn)一步的對核酸免疫的各個環(huán)節(jié)進(jìn)行優(yōu)化。 結(jié)論：已通過酶切鑒定和測序分析,pcDNA3.1-F構(gòu)建準(zhǔn)確,Western-blot證明了蛋白在細(xì)胞中正確表達(dá),免疫小鼠也同樣獲得了特異性抗體,說明pcDNA3.1-F質(zhì)粒能夠在動物體內(nèi)表達(dá),并且F蛋白編碼基因具有良好的免疫原性。為后續(xù)的肝特異性F蛋白單克隆抗體的制備及其免疫試劑的研制開發(fā)做好了前期的鋪墊。但要想得到高表達(dá)量的特異性抗體還需要對表達(dá)載體、免疫過程等方面進(jìn)一步優(yōu)化。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R392.1

【參考文獻(xiàn)】

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1 劉春香;劉菊;趙光強(qiáng);郭淑華;;質(zhì)粒DNA免疫小鼠制備IGF-Ⅱ抗體的研究[J];安徽農(nóng)業(yè)科學(xué);2008年30期

2 車小燕,錢其軍,劉思行,黃潔,邱慶林,徐華,吳文翰;特異性靶向的戊肝嵌合DNA疫苗的構(gòu)建及免疫效果研究[J];第一軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報;2002年02期

3 ;Allolymphocyte apoptosis induced by soluble liver specific antigen[J];Hepatobiliary & Pancreatic Diseases International;2003年02期

4 鄭春福,陳雅棠;DNA疫苗的載體及其主要結(jié)構(gòu)特征[J];國外醫(yī)學(xué).預(yù)防.診斷.治療用生物制品分冊;2000年04期

5 黃春妍;核酸疫苗抗原提呈機(jī)理研究進(jìn)展[J];國外醫(yī)學(xué)(免疫學(xué)分冊);2003年02期

6 許德明,劉路,何伶俐;血清F對AFP陰性或低濃度原發(fā)性肝癌的診斷分析[J];河南腫瘤學(xué)雜志;1998年02期

7 倪健;;抗體組學(xué)和抗體組藥物研究進(jìn)展與展望[J];現(xiàn)代免疫學(xué);2006年04期

8 杜明梅;葉玲;劉建偉;劉靜;楊立娜;;Kozak序列+4G提高綠色熒光蛋白在HEK293細(xì)胞中的表達(dá)[J];生物工程學(xué)報;2008年03期

9 王明連,李勁松;DNA疫苗的轉(zhuǎn)染載體及免疫途徑[J];生物技術(shù)通訊;2002年02期

10 吳庭才;張春杰;;核酸疫苗的特點(diǎn)、組成及在動物免疫中的應(yīng)用[J];生物學(xué)通報;2009年05期

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本文編號：2422412