【摘要】： 背景與目的 胎盤是人類胚胎發(fā)育成熟、妊娠順利完成的基本要素。晚期囊胚著床之后,絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞(extravillous trophoblast cell, EVT)向子宮蛻膜層和肌層血管的進(jìn)一步侵襲、遷移、分化是母-胎循環(huán)建立和胎盤錨著固定的關(guān)鍵環(huán)節(jié),對胎盤的形成尤為重要。已證實(shí),EVT侵襲性遷移不足可導(dǎo)致子宮螺旋動(dòng)脈重鑄不足,是流產(chǎn)、子癇前期/子癇、胎兒宮內(nèi)生長受限等疾病的重要病理過程;同時(shí),滋養(yǎng)細(xì)胞過度侵襲則是胎盤植入、葡萄胎、絨癌等疾病的重要病理特征。明確滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲性遷移的調(diào)節(jié)機(jī)制,是解決上述疾病的關(guān)鍵問題與希望所在。EVT的侵襲性遷移是由細(xì)胞粘附、胞外基質(zhì)降解、運(yùn)動(dòng)遷移、穿越基底膜等多個(gè)環(huán)節(jié)構(gòu)成多元化過程,受到體內(nèi)微環(huán)境的精確調(diào)節(jié)。蛻膜/胎盤等局部器官、組織和/或機(jī)體其它器官、組織分泌的內(nèi)源性因子如內(nèi)分泌激素、細(xì)胞因子等能夠作用于EVT的侵襲性遷移過程,是調(diào)節(jié)該過程的重要因素。但各種因素調(diào)節(jié)EVT侵襲性遷移的確切分子機(jī)制至今尚未闡明。 表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)是一種對機(jī)體發(fā)育、代謝等多種生物學(xué)過程具有調(diào)節(jié)作用的重要的生長因子。已有證據(jù)表明,EGF及EGFR在人類妊娠組織的蛻膜層和滋養(yǎng)層均有表達(dá),且EGF在滋養(yǎng)層的表達(dá)水平隨妊娠進(jìn)展而逐漸下降,提示其在妊娠早期滋養(yǎng)層的發(fā)育過程中扮演重要角色。研究發(fā)現(xiàn),EGF對滋養(yǎng)層細(xì)胞的增殖、凋亡、分化、能量代謝、激素分泌、侵襲和遷移等多種生物學(xué)行為均存在調(diào)控,妊娠動(dòng)物母體EGF的缺乏亦可造成明確的胎盤發(fā)育不良、子代宮內(nèi)生長受限。因此,EGF對滋養(yǎng)細(xì)胞功能的調(diào)控研究成為本領(lǐng)域近年來的重要方向。 EGF通過與細(xì)胞表面表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)的高親和力結(jié)合而使EGFR內(nèi)在的酪氨酸激酶活性激活,啟動(dòng)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)反應(yīng)。已發(fā)現(xiàn)受EGF/EGFR激活的信號(hào)通路包括:Ras/MAPK,PI3K/Akt,PLC/PKC和STAT等。Rho亞家族蛋白(Rho subfamily)屬于Ras超家族小分子G蛋白范疇,主要包括RhoA、RhoB、RhoC等3個(gè)成員,它們在細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中作為分子開關(guān)作用于其下游靶效應(yīng)分子調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的聚合與重建,進(jìn)而參與調(diào)控細(xì)胞的粘附、細(xì)胞的極性和細(xì)胞遷移。Rho亞家族成員具有高度同源性,RhoA、RhoB、RhoC蛋白的氨基序列結(jié)構(gòu)約有85%相同,但在胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)通路中的分工有所不同。早已發(fā)現(xiàn),EGFR的激活能夠通過Rho信號(hào)途徑調(diào)節(jié)胞膜皺縮、骨架重組、局部粘附等對遷移、運(yùn)動(dòng)至關(guān)重要的細(xì)胞行為特性,但Rho 蛋白各亞型在EGF介導(dǎo)的人滋養(yǎng)細(xì)胞遷移中的作用及機(jī)制至今未見報(bào)道。JEG-3和JAR細(xì)胞系分別來自人絨毛膜癌和人胎盤部位滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤組織,其細(xì)胞形態(tài)、生化標(biāo)志、激素合成分泌等特征與原代絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞極其相似,且細(xì)胞表面均表達(dá)EGFR。本研究基于JEG-3、JAR等兩種滋養(yǎng)細(xì)胞系和人早孕絨毛體外培養(yǎng)等實(shí)驗(yàn)平臺(tái),應(yīng)用Transwell、Western blot、RNAi等實(shí)驗(yàn)技術(shù),研究并探討Rho亞家族蛋白在EGF介導(dǎo)的人滋養(yǎng)細(xì)胞遷移中的作用及其機(jī)制。 主要結(jié)果和結(jié)論如下: 1.EGF以劑量依賴模式作用于人滋養(yǎng)細(xì)胞的遷移行為。在測試的濃度中,1ng/ml的EGF最大程度的上調(diào)JEG-3、JAR細(xì)胞的遷移行為(P 0.01);濃度升高至10ng/ml時(shí)其上調(diào)效應(yīng)有所下降;濃度升高至100ng/ml時(shí)EGF的遷移調(diào)節(jié)作用轉(zhuǎn)為抑制(P 0.01)。相同的實(shí)驗(yàn)條件下,JEG-3、JAR細(xì)胞的數(shù)目、增殖、凋亡等無顯著變化。 2.Rho蛋白活性抑制劑-C3胞外酶(5mg/ml)顯著抑制JEG-3、JAR細(xì)胞的遷移(P 0.01);C3預(yù)處理細(xì)胞后,EGF對細(xì)胞遷移的激活作用也被抑制(P 0.01);相同實(shí)驗(yàn)條件下,細(xì)胞的數(shù)目、增殖、凋亡等無顯著變化;同時(shí),EGF還顯著上調(diào)早孕絨毛組織EVT細(xì)胞的外生性遷移(P 0.01),而C3可將此作用阻斷(P 0.01)。 3.EGF處理JEG-3、JAR細(xì)胞后,RhoA和RhoC的表達(dá)顯著上調(diào)(P 0.01),而RhoB的表達(dá)輕微下調(diào)(P 0.01),EGF處理絨毛組織后Rho表達(dá)譜與細(xì)胞結(jié)果相近;在3種實(shí)驗(yàn)平臺(tái),EGF處理均使處于活性狀態(tài)的RhoA和RhoC水平升高(P 0.01),而RhoB水平無顯著變化。 4.分別沉默RhoA和RhoC均能顯著的抑制JEG-3、JAR細(xì)胞的遷移行為(P 0.05),EGF對細(xì)胞遷移的刺激作用也同時(shí)被抑制(P 0.01);相同實(shí)驗(yàn)條件,沉默RhoA和RhoC對細(xì)胞的數(shù)目、增殖、凋亡等行為均無顯著影響。 5.C3處理(5mg/ml, 2h)的JEG-3、JAR細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞皺縮、細(xì)胞微絲骨架解聚、不規(guī)則等表現(xiàn),C3處理之后應(yīng)用EGF刺激不能使細(xì)胞形態(tài)和骨架復(fù)原。沉默RhoA (100nM, 24h)后細(xì)胞出現(xiàn)與C3處理相似的細(xì)胞皺縮、骨架解聚等表現(xiàn),不能被EGF復(fù)原。而RhoC沉默(100nM, 24h)后細(xì)胞的形態(tài)、微絲骨架等未發(fā)生明顯可見的變化。 上述結(jié)果表明:低濃度的EGF(1ng/ml)能夠刺激JEG-3、JAR遷移上調(diào),促進(jìn)EVT細(xì)胞自培養(yǎng)絨毛組織的外生性遷移,而高濃度EGF(100ng/ml)顯著抑制JEG-3、JAR遷移;EGF對滋養(yǎng)細(xì)胞遷移行為的上調(diào)依賴于RhoA和RhoC的表達(dá)、激活水平上調(diào),而非RhoB。同時(shí),RhoA通過細(xì)胞微絲骨架的重組來參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的遷移行為,而RhoC對細(xì)胞遷移的調(diào)節(jié)不依賴于微絲骨架。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R321

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本文編號(hào)：2419964