【摘要】： 單克隆抗體一直以來(lái)都被作為研究T淋巴細(xì)胞表面分子的重要工具。國(guó)外研制的雞CD分子的單克隆抗體為研究免疫細(xì)胞的生理功能及細(xì)胞表面標(biāo)志的生物學(xué)作用等創(chuàng)造了有利條件,他們可以利用這些單克隆抗體對(duì)淋巴細(xì)胞進(jìn)行分選,以研究免疫應(yīng)答類(lèi)型;或用于消耗動(dòng)物體內(nèi)相應(yīng)的CD分子,以研究CD分子在體內(nèi)的作用;也可用于研究CD分子的結(jié)構(gòu)、功能等。本實(shí)驗(yàn)旨在研制特異性的抗雞CD8α的單克隆抗體,特別是適用于間接免疫熒光試驗(yàn)、細(xì)胞分析與分選等流式細(xì)胞術(shù)的單克隆抗體。 研究中首先利用淋巴細(xì)胞分離液制備白萊航雞脾臟和胸腺的淋巴細(xì)胞,接著用制備的淋巴細(xì)胞免疫3只6周齡的雌性BALB/c小鼠。在經(jīng)過(guò)兩次免疫后,眼靜脈竇采血,分離血清,應(yīng)用間接免疫熒光試驗(yàn)測(cè)定血清效價(jià)。達(dá)到1:1280后,進(jìn)行加強(qiáng)免疫。3天后,無(wú)菌條件下取BALB/c小鼠的脾臟細(xì)胞與培養(yǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的小鼠骨髓瘤細(xì)胞系SP2/0在PEG4000的作用下進(jìn)行融合。5天后添加新鮮的HAT培養(yǎng)基,10天后更換HT培養(yǎng)基。待融合細(xì)胞上清變黃后即可進(jìn)行陽(yáng)性克隆的篩選。 采用間接免疫熒光染色結(jié)合FACS分析篩選陽(yáng)性克隆。應(yīng)用本室構(gòu)建的穩(wěn)定表達(dá)雞CD8α的細(xì)胞系Flp-in-293-CD8α-FLAG與雜交瘤上清進(jìn)行間接免疫熒光染色,通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)熒光率篩選出陽(yáng)性雜交瘤克隆。同時(shí)設(shè)立商品化的純化的鼠抗雞CD8α抗體的陽(yáng)性對(duì)照。再經(jīng)過(guò)2次有限稀釋法亞克隆,篩選到了一株穩(wěn)定分泌抗雞CD8α的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞,命名為6E5。將雜交瘤細(xì)胞6E5腹腔注射預(yù)先用石蠟處理的BALB/c小鼠,制備6E5腹水。間接免疫熒光FACS試驗(yàn)測(cè)定腹水效價(jià),達(dá)到1:1204000。應(yīng)用抗原介導(dǎo)的ELISA方法,測(cè)得6E5的亞類(lèi)為IgG1。 應(yīng)用CD3/CD8雙色免疫熒光結(jié)合FACS分析進(jìn)一步鑒定單克隆抗體。取白萊航雞的脾臟淋巴細(xì)胞,第一步通過(guò)間接染色的方法標(biāo)記6E5抗鼠FITC,第二步通過(guò)直接染色的方法標(biāo)記CD3-PE。同時(shí)設(shè)立商品化的純化的鼠抗雞CD8α抗體為一抗的陽(yáng)性對(duì)照。結(jié)果顯示,6E5是一株分泌抗雞CD8α的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞。 將6E5與商品化的鼠抗雞CD8α抗體(CLONE:CT8)進(jìn)行抗原表位的比較。取白萊航雞的淋巴細(xì)胞,加入不同含量的6E5雜交瘤細(xì)胞制備的腹水,接著加入相應(yīng)含量的CD8-PE(CLONE:CT8)。如果6E5與商品化的鼠抗雞CD8α抗體(CLONE:CT8)是識(shí)別相同的表位,那么隨著6E5腹水量的升高,熒光率應(yīng)該降低。但是實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明,熒光率不隨著6E5濃度的升高而降低,說(shuō)明兩者不是針對(duì)同一抗原表位。 應(yīng)用單克隆抗體6E5測(cè)定與白萊航品系雞不同組織中淋巴細(xì)胞的反應(yīng)性。取白萊航雞的胸腺、脾臟、法氏囊淋巴細(xì)胞,與6E5腹水分別反應(yīng)。結(jié)果表明,6E5可以識(shí)別胸腺、脾臟淋巴細(xì)胞里表達(dá)CD8 T淋巴細(xì)胞。但是不與法氏囊淋巴細(xì)胞反應(yīng),這主要是因?yàn)榉ㄊ夏伊馨图?xì)胞是B淋巴細(xì)胞。 應(yīng)用單克隆抗體6E5測(cè)定與不同品種(系)的家禽的淋巴細(xì)胞的反應(yīng)性。選取隱性白羽雞、石岐雜雞、狼山雞、安卡雞、龍溪麻雞、康貝爾鴨、鴉鴨、揚(yáng)州鵝八種家禽,分別采集外周血,制備外周血淋巴細(xì)胞,測(cè)定6E5與不同品系的家禽的淋巴細(xì)胞的反應(yīng)性。結(jié)果顯示,6E5可以特異的識(shí)別雞的外周血淋巴細(xì)胞中表達(dá)CD8的T淋巴細(xì)胞,不能識(shí)別康貝爾鴨、鴉鴨、揚(yáng)州鵝外周血淋巴細(xì)胞。 在雞的免疫試驗(yàn)中,進(jìn)一步應(yīng)用單克隆抗體6E5測(cè)定了不同免疫組的雞的免疫水平。 利用本室構(gòu)建的豬霍亂沙門(mén)菌C500△asd(pYA3334)菌株、豬霍亂沙門(mén)菌C500△asd(pYA3334-F)菌株免疫20日齡海蘭白雞,同時(shí)設(shè)立不免疫的陰性對(duì)照。在第一次免疫后14天、第二次免疫后7天、第二次免疫后14天,分別取不同免疫組的海蘭白雞,制備脾臟淋巴細(xì)胞,利用間接方法標(biāo)記6E5抗鼠PE。再標(biāo)記CD4-FITC,流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD4與CD8百分含量。同時(shí)設(shè)立商品化鼠抗雞CD8α抗體的陽(yáng)性對(duì)照。通過(guò)CD4與CD8的百分含量的比值判斷不同免疫組的白萊航雞的免疫水平。6E5測(cè)得的結(jié)果與商品化的鼠抗雞CD8α抗體得到的結(jié)果相同。說(shuō)明6E5是一株可以應(yīng)用于流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)的單克隆抗體。
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【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類(lèi)號(hào)】：R392

【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 劉明如;弓形蟲(chóng)單克隆抗體的制備及生物學(xué)活性的初步鑒定[D];廣西大學(xué);2012年

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本文編號(hào)：2416638