【摘要】： 腎綜合征出血熱(HFRS)是一種由漢坦病毒引起的急性傳染病,臨床上以發(fā)熱、出血和急性腎功能損害為主要特征。我國是HFRS危害最嚴(yán)重的國家,年發(fā)病人數(shù)為5~10萬人,其流行范圍廣、發(fā)病人數(shù)多、病死率較高。臨床上尚缺乏特異有效的治療方法。國內(nèi)外近年來雖已研制出HFRS的滅活疫苗,但從部分人群試用的情況來看,該類疫苗還存在明顯不足,尤其是不能有效地刺激細(xì)胞免疫應(yīng)答。因此仍需針對(duì)滅活疫苗存在的不足,進(jìn)一步研究更為有效的HFRS新型疫苗。 漢坦病毒是一種有囊膜的單股負(fù)鏈RNA病毒,基因組分為L、M、S三個(gè)節(jié)段,分別編碼病毒的RNA依賴的RNA聚合酶、包膜糖蛋白(G1和G2)以及核衣殼蛋白(NP)。以往研究表明,漢坦病毒的M基因編碼的包膜糖蛋白(GP)可刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體,而對(duì)感染動(dòng)物和人體起到保護(hù)作用;但GP免疫原性較弱,刺激產(chǎn)生的抗體出現(xiàn)晚,滴度不高。NP是該病毒結(jié)構(gòu)蛋白中免疫原性最強(qiáng)的,其刺激機(jī)體產(chǎn)生的特異性抗體出現(xiàn)早、滴度高、維持時(shí)間長,并且還有誘導(dǎo)機(jī)體細(xì)胞免疫應(yīng)答的作用。由于漢坦病毒中和抗原表位主要存在于病毒GP上,目前HFRS基因工程疫苗的基礎(chǔ)研究主要集中于GP。該方面的研究雖已取得較大進(jìn)展,但由于GP相對(duì)較弱的免疫原性,故免疫效果仍不理想。國內(nèi)外研究表明,漢坦病毒GP和NP在誘導(dǎo)機(jī)體免疫應(yīng)答中可能均起重要作用,因此,如何發(fā)揮其不同結(jié)構(gòu)蛋白在誘導(dǎo)機(jī)體免疫應(yīng)答中的優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)作用,是HFRS基因工程疫苗研究中亟待解決的問題。 本室前期曾將漢灘病毒(HTNV)76-118株的M基因分別與編碼NP氨基端aa1~247的S基因片段(S0.7,編碼NP主要抗原區(qū)段)拼接,利用桿狀病毒和腺病毒表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行融合表達(dá)以及表達(dá)產(chǎn)物的免疫學(xué)分析。結(jié)果證實(shí)HTNV 76-118株G1S0.7和G2S0.7嵌合基因均能刺激機(jī)體的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答。然而在研究中我們也發(fā)現(xiàn)了一些問題,如盡管免疫小鼠后各表達(dá)系統(tǒng)均能刺激機(jī)體產(chǎn)生體液及細(xì)胞免疫應(yīng)答,且腺病毒表達(dá)系統(tǒng)的效果要優(yōu)于其他系統(tǒng),但是整體的免疫水平還不十分理想,特別是刺激機(jī)體細(xì)胞免疫應(yīng)答的水平不高。國內(nèi)外已證實(shí)漢坦病毒感染后以CTL為主的T細(xì)胞應(yīng)答對(duì)于機(jī)體保護(hù)有重要作用,因此利用漢坦病毒CTL表位結(jié)合結(jié)構(gòu)蛋白構(gòu)建疫苗可能是一種可行的方案。 本研究在前期工作基礎(chǔ)上,利用基因重組技術(shù),構(gòu)建了含有HTNV M基因(編碼糖蛋白G1、G2)和部分S基因(編碼NP主要抗原區(qū)段)以及S基因的多個(gè)CTL表位的多種重組腺病毒,在對(duì)這些重組腺病毒進(jìn)行系統(tǒng)鑒定的基礎(chǔ)上,觀察了其刺激小鼠體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答的能力。 1、將HTNVG1S0.7和G2S0.7嵌合基因片段分別與合成的CTL表位串聯(lián)基因CTL1(表位間加間隔序列AAY)及CTL2(表位間不加間隔序列AAY)以不同組合方式克隆到腺病毒轉(zhuǎn)移載體pShuttle中,CTL表位拼接于S0.7 3’端,通過酶切鑒定選取陽性克隆,分別命名為pG1S0.7CTL1、pG1S0.7CTL2、pG2S0.7CTL1、pG1S0.7CTL2。 2、通過特異性的I-Ceu I和PI-Sce I酶切后將重組轉(zhuǎn)移載體與Adeno-X載體病毒DNA相連,電轉(zhuǎn)化E.coli JM109,并用PCR方法進(jìn)行了篩選和鑒定,獲得重組腺病毒的DNA,轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞得到重組腺病毒原種,分別命名為AG1S0.7CTL1、AG1S0.7CTL2、AG2S0.7CTL1、AG1S0.7CTL2。 3、將各重組腺病毒經(jīng)CsCl密度梯度離心純化及測(cè)定滴度后分別感染HEK293和Vero-E6細(xì)胞。IFA和ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示,各重組腺病毒均可在細(xì)胞中表達(dá)相應(yīng)HTNV抗原,表明CTL表位的插入并沒有影響相應(yīng)抗原的表達(dá)及其與特異性單克隆抗體(mAb)的結(jié)合活性。Western-blot分析結(jié)果顯示,各重組腺病毒組在HEK293細(xì)胞中均可表達(dá)能與特異性mAb產(chǎn)生反應(yīng)、相對(duì)分子質(zhì)量(Mr)分別約為97KDa和80KDa的融合蛋白,與預(yù)期融合蛋白大小相符,表明重組腺病毒在HEK293細(xì)胞中表達(dá)的為完整的融合蛋白。 4、以各重組腺病毒分別經(jīng)腹腔注射免疫Balb/c小鼠,通過IFA、ELISA、微量細(xì)胞中和試驗(yàn)、T淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)、CTL殺傷試驗(yàn)、細(xì)胞因子檢測(cè)等方法觀察免疫效果。結(jié)果表明,各重組腺病毒免疫小鼠均可刺激機(jī)體產(chǎn)生低滴度的抗NP(1∶160~1∶320)和抗GP抗體(1∶20~1∶40),同時(shí)也可產(chǎn)生效價(jià)約1∶5~1∶40的低滴度中和抗體。各重組腺病毒均可誘導(dǎo)小鼠體內(nèi)特異的細(xì)胞免疫應(yīng)答,其中AG2S0.7CTL1免疫組小鼠脾細(xì)胞對(duì)NP及GP的增殖指數(shù)明顯高于對(duì)照組;AG1S0.7CTL2、AG2S0.7CTL1、AG2S0.7CTL2組增殖指數(shù)也都略高于AG1S0.7和AG2S0.7組,表明加有CTL多表位的重組腺病毒能更有效地刺激小鼠的細(xì)胞免疫應(yīng)答。CTL殺傷試驗(yàn)的結(jié)果表明,各重組腺病毒免疫組在不同的效/靶比條件下均可誘導(dǎo)針對(duì)靶細(xì)胞的特異性殺傷效應(yīng),并隨著效/靶比的提高,殺傷效應(yīng)也相應(yīng)提高;其中含有CTL多表位的四種重組腺病毒免疫所誘導(dǎo)的CTL殺傷效應(yīng)明顯高于不含CTL表位的兩種重組腺病毒。對(duì)在CTL多表位間加入或不加入間隔序列AAY的各重組腺病毒的比較來看,在CTL多表位間加入間隔序列AAY的重組腺病毒免疫小鼠能產(chǎn)生更高的細(xì)胞免疫應(yīng)答,表明間隔序列AAY對(duì)于各CTL表位的分隔能提高重組腺病毒的免疫效果。對(duì)各重組腺病毒免疫小鼠血清中細(xì)胞因子檢測(cè)的結(jié)果顯示,各重組腺病毒均可刺激Th1類細(xì)胞因子(INF-γ、IL-2、IL-12)水平的提高,而Th2類細(xì)胞因子水平變化不明顯。說明重組腺病毒免疫小鼠后可以刺激機(jī)體Th1類細(xì)胞的優(yōu)勢(shì)應(yīng)答,從而有助于提高小鼠的細(xì)胞免疫應(yīng)答能力。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R392;R512.8

【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 馬慶慶;HFRS疫苗志愿接種者PBL中CD4~+T、CD8~+T細(xì)胞TCRβ鏈CDR3譜系的監(jiān)測(cè)及CDR3分子特征初步分析[D];遵義醫(yī)學(xué)院;2011年

，

本文編號(hào)：2413867