【摘要】： 4-1BBL(CD137L)是Ⅱ型跨膜糖蛋白分子,TNF超家族成員,表達(dá)于各種活化的抗原提呈細(xì)胞(APC)表面,如IFN-γ活化的巨噬細(xì)胞、CD40配體活化的B細(xì)胞、單核細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞(DC)、T細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞等。編碼人4-1BBL的基因位于19p13.3。其受體4-1BB(CD137)為TNF受體(TNFR)超家族成員,分子量為30KD的Ⅰ型跨膜糖蛋白,表達(dá)于活化的CD4~+T和CD8~+T細(xì)胞表面。4-1BB/4-1BBL介導(dǎo)的協(xié)同刺激信號可以誘導(dǎo)T細(xì)胞的活化,增殖及抗凋亡作用,同時還可維持T細(xì)胞的長期生存及提高細(xì)胞因子的分泌。4-1BB/4-1BBL可以協(xié)同CD28/B7促進(jìn)T細(xì)胞IL-2的分泌,4-1BBL亦可獨(dú)立于CD28傳遞協(xié)同刺激信號聯(lián)合TCR信號參與T細(xì)胞的活化,并在初次免疫應(yīng)答的后期,二次免疫應(yīng)答及免疫記憶中發(fā)揮效應(yīng)。4-1BBL還可介導(dǎo)逆向信號誘導(dǎo)單核細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞的增殖及促進(jìn)其細(xì)胞因子的分泌。這種逆向信號可能在腫瘤免疫應(yīng)答中起至關(guān)重要的作用。4-1BBL分子的激動劑或拮抗劑的研制及其在4-1BB/4-1BBL信號傳導(dǎo)調(diào)節(jié)作用的研究在腫瘤、移植排斥反應(yīng)、自身免疫性疾病中具有重要的理論研究意義和應(yīng)用價(jià)值。 1.本研究以4-1BBL轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株L929/4-1BBL為免疫原,免疫BALB/c小鼠,采用B淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù),將免疫后小鼠的脾臟細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0進(jìn)行細(xì)胞融合,以L929/4-1BBL細(xì)胞株作為陽性細(xì)胞株,以轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的母本細(xì)胞L929作為陰性對照細(xì)胞株,經(jīng)免疫熒光標(biāo)記分析及抗體分泌陽性孔內(nèi)細(xì)胞的反復(fù)篩選并經(jīng)多次的克隆化培養(yǎng),最終獲得1株持續(xù)、穩(wěn)定分泌鼠抗人4-1BBL單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株,命名為3E7。經(jīng)體外長期傳代培養(yǎng)和液氮凍存后復(fù)蘇,雜交瘤細(xì)胞生長良好,分泌抗體的性能穩(wěn)定。該抗體效價(jià)在1:1000以上,純化后抗體蛋白用于間接免疫熒光分析的用量為0.25～2.0μg/1×10~6細(xì)胞。經(jīng)快速定性試紙法鑒定單抗3E7的重鏈為IgG1。單抗3E7與商品化單抗C65-485識別4-1BBL分子的抗原位點(diǎn)不同。 2.為了研究單克隆抗體對4-1BBL分子表達(dá)細(xì)胞的識別和結(jié)合,選擇表達(dá)4-1BBL膜分子的人單核性白血病細(xì)胞株U937以及SHI-1、人早幼粒白血病細(xì)胞株HL-60、人紅白血病細(xì)胞株K562、惡性B淋巴瘤細(xì)胞株Daudi和骨髓瘤細(xì)胞株8226,通過間接免疫熒光標(biāo)記法及流式細(xì)胞儀分析,結(jié)果顯示,單抗3E7能特異性的地識別上述血液系統(tǒng)惡性腫瘤細(xì)胞株上表達(dá)的4-1BBL分子。 3.經(jīng)過細(xì)胞計(jì)數(shù)、光鏡觀察及流式細(xì)胞儀分析證實(shí)單抗3E7能介導(dǎo)逆向信號誘導(dǎo)人單核細(xì)胞在體外有效擴(kuò)增(3～4倍),進(jìn)一步用ELISA檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清,結(jié)果顯示,單抗3E7能有效地促進(jìn)單核細(xì)胞分泌IL-6和TNF-α。 4.流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示,HL-60細(xì)胞和U937細(xì)胞表面表達(dá)4-1BBL膜蛋白;與流式結(jié)果相應(yīng),RT-PCR檢測到HL-60細(xì)胞和U937細(xì)胞有4-1BBL mRNA胞外段轉(zhuǎn)錄本,可見HL-60細(xì)胞和U937細(xì)胞膜表面組成性表達(dá)4-1BBL分子。細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯示,4-1BBL單抗3E7能顯著促進(jìn)HL-60細(xì)胞和U937細(xì)胞的體外生長,提示HL-60細(xì)胞和U937細(xì)胞上的4-1BBL分子同樣能夠介導(dǎo)逆向信號,并且通過逆向信號促進(jìn)這兩種白血病細(xì)胞株的生長,促進(jìn)其分泌IL-6,使之進(jìn)入S期的細(xì)胞比例增加。 5.用4-1BBL單抗3E7和TLR-4商品抗體標(biāo)記HL-60細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)HL-60細(xì)胞組成性共表達(dá)4-1BBL分子和TLR-4分子,激光共聚焦顯微鏡觀測到HL-60細(xì)胞上存在4-1BBL與TLR-4的共定位現(xiàn)象。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),4-1BBL與TLR-4在37℃條件下出現(xiàn)了共內(nèi)吞,由此表明4-1BBL確實(shí)在功能上與TLR-4有一定的關(guān)系。 綜上所述,本研究成功的地獲得了1株穩(wěn)定和特異分泌抗人4-1BBL的功能性單克隆抗體的雜交瘤(3E7),證實(shí)所分泌的抗人4-1BBL單克隆抗體通過逆向信號顯著地誘導(dǎo)人外周血單核細(xì)胞的體外生長。單抗3E7可促進(jìn)白血病腫瘤細(xì)胞株HL-60和U937體外生長和細(xì)胞因子分泌。并首次觀測到4-1BBL分子和TLR-4分子在HL-60細(xì)胞株表面共定位,37℃條件下出現(xiàn)了共內(nèi)吞。這株抗體為深入探討腫瘤細(xì)胞表達(dá)4-1BBL分子的生物學(xué)意義提供了物質(zhì)基礎(chǔ),也為靶向治療打下了物質(zhì)基礎(chǔ)。
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【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R392

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 邱玉華，張學(xué)光，謝煒，朱學(xué)東;一種顯著提高小鼠生產(chǎn)單抗腹水產(chǎn)量的新方法[J];中國免疫學(xué)雜志;1995年06期

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本文編號：2407555