【摘要】： 細(xì)菌耐藥性是21世紀(jì)全球性的難題和關(guān)注的熱點(diǎn)。抗菌藥物長期、廣泛和不合理使用以及抗菌藥物的選擇壓力等原因使耐藥菌株不斷增多、耐藥譜日益擴(kuò)大,有的菌株甚至對尚未用于臨床的新型抗菌藥物也表現(xiàn)出了耐藥性。喹諾酮類抗菌藥物進(jìn)入我國僅僅20多年,但耐藥率卻不斷上升,如全球銷量最大的環(huán)丙沙星,大腸桿菌對之耐藥率高達(dá)60%～70%,腸球菌和葡萄球菌對之耐藥率也增加了20%～40%不等。世界衛(wèi)生組織早在1996年向世界各國發(fā)出警告,細(xì)菌的耐藥性正在不斷增強(qiáng),有可能使結(jié)核病再次成為不治之癥。鑒于以上原因,研制新一代高效安全廉價(jià)的新型抗菌制劑迫在眉睫。 噬菌體作為細(xì)菌病毒,能特異感染和裂解宿主菌,自發(fā)現(xiàn)之初,它便被定位于進(jìn)行生物抗菌,早期由于抗生素的發(fā)現(xiàn)和發(fā)展以及學(xué)者對噬菌體基本特性認(rèn)識的匱乏,相關(guān)研究一度陷入低谷,但隨著抗生素耐藥現(xiàn)象日趨嚴(yán)重,噬菌體生物抗菌重新煥發(fā)生機(jī)。鑒于噬菌體抗菌的專一宿主性、環(huán)境親和性、經(jīng)濟(jì)方便和持續(xù)性等特點(diǎn),噬菌體抗菌應(yīng)用技術(shù)是未來重要的發(fā)展方向,是人類有效利用自然資源、進(jìn)行持續(xù)發(fā)展的重要途徑。相關(guān)應(yīng)用在醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)、食品工作和環(huán)境保護(hù)中已顯露身手,并逐趨成熟。 然而,噬菌體的宿主高特異性仍然在很大程度上限制了它的應(yīng)用,一些噬菌體的宿主譜僅局限在某一科、某一屬、某一種甚至某一株細(xì)菌,而對其它菌株裂解效果很弱或無治療作用,使其應(yīng)用的范圍受到很大的限制。而對噬菌體進(jìn)行人工改造以滿足增加噬菌體宿主譜的需要是解決這個(gè)問題的關(guān)鍵,目前已經(jīng)成為研究熱點(diǎn)之一。 本課題旨在從醫(yī)院污水樣本中分離新型多價(jià)大腸桿菌噬菌體,并觀察分析其基本生物學(xué)特征和核酸屬性,并從基因組學(xué)和蛋白組學(xué)兩方面著手,結(jié)合生物信息學(xué)相關(guān)研究方法,對其進(jìn)行屬性分析和功能研究,探討噬菌體多價(jià)特性的分子識別機(jī)制,為下一步進(jìn)行噬菌體人工改造并應(yīng)用與生物抗菌領(lǐng)域奠定理論基礎(chǔ)。研究內(nèi)容和結(jié)果可以概括為如下幾個(gè)方面: 1.在對醫(yī)院污水樣本的大規(guī)模篩選中,分離到一株新型多價(jià)大腸桿菌噬菌體,針對多株大腸桿菌效價(jià)均在109pfu/mL以上;通過噬菌體雙層瓊脂法培養(yǎng)、透射電鏡、一步生長曲線、核酸電泳及分光光度測量等技術(shù),觀察噬菌斑、超微結(jié)構(gòu)、核酸性質(zhì)及生長曲線特征,確定噬菌體285P的噬菌斑直徑約4-5mm,透明,大小均勻,邊緣清楚,無暈環(huán);電鏡觀察顯示噬菌體顆粒呈微球型,邊緣光滑,隸屬于短尾病毒科(Podoviridae),頭部直徑約40-48nm,尾部約為8×23nm;一步生長曲線顯示噬菌體285P的5min吸附率為80.3%,潛伏期是21min,平均釋放量為88個(gè);分光光度法及核酸酶切法均證實(shí)核酸為雙鏈DNA(dsDNA)。 2.利用Shotgun全基因組測序技術(shù)完成了噬菌體285P的全基因組測序,大小為39270bp,通過blast比對證實(shí)為一株新的噬菌體,并對它進(jìn)行了基因組注釋和進(jìn)化分析,分析出43個(gè)有效ORF,堿基長度從81到3948bp大小不等,利用blast比對預(yù)測它們的功能,主要包括尾絲蛋白、尾蛋白、主要衣殼蛋白、溶菌酶、病毒內(nèi)部蛋白及核酸內(nèi)外切酶等;并通過SWISS-MODEL對主要蛋白進(jìn)行了同源建模; 3.結(jié)合SDS-PAGE電泳、雙向電泳及質(zhì)譜分析技術(shù),并和基因組學(xué)數(shù)據(jù)相互佐證,確定了噬菌體285P的三條主要蛋白即重要衣殼蛋白、尾蛋白和尾絲蛋白。 4.重點(diǎn)從尾絲蛋白的結(jié)構(gòu)性質(zhì)等方面對噬菌體285P的宿主識別機(jī)制進(jìn)行了探討,對其蛋白的一級結(jié)構(gòu)、二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析,并構(gòu)建了進(jìn)化樹、氨基酸組分分析、多序列clustal比對以及親水性、柔韌性、抗原指數(shù)和表面可能性等理化性質(zhì)的分析,利用TMHMM Server v. 2.0對尾絲蛋白的跨膜區(qū)域進(jìn)行分析,并與噬菌體T7、BA14進(jìn)行了比較分析,利用類推法進(jìn)行演繹,推定噬菌體285P通過尾絲蛋白特異地吸附到特定宿主菌的表面脂多糖外膜中的二糖基殘基來實(shí)現(xiàn)宿主識別功能,為下一步進(jìn)行尾絲蛋白的克隆表達(dá)及應(yīng)用研究奠定了基礎(chǔ)。 綜上所述,本研究首先從大量的環(huán)境樣本中篩選出了新型多價(jià)大腸桿菌噬菌體285P,并對其基本生物學(xué)特性和核酸屬性進(jìn)行了觀察分析;通過相關(guān)蛋白研究技術(shù)確定了三條主要蛋白組分,并對他們進(jìn)行了定性和定量,為下一步功能研究奠定了基礎(chǔ);進(jìn)行了全基因組Shotgun測序,確定了其39270個(gè)堿基組成,并進(jìn)行了功能注釋;對噬菌體的宿主識別器官—尾絲進(jìn)行了重點(diǎn)探討,為下一步進(jìn)行重組表達(dá)及將之?dāng)U展至其他種屬細(xì)菌,并進(jìn)一步研究基因工程改造多價(jià)噬菌體技術(shù),應(yīng)用于環(huán)境消毒、獸醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)和食品加工處理等領(lǐng)域奠定了基礎(chǔ)。
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【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R378

【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 汪芳;彭菊芳;劉清梅;;耐青霉素大腸桿菌噬菌體的篩選及其特性研究[J];環(huán)境與健康雜志;2010年12期

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本文編號：2407416