【摘要】： 肺炎鏈球菌是引起肺炎、腦膜炎、中耳炎的主要致病菌,是引起世界范圍嬰幼兒、老年人、免疫缺陷個(gè)體感染的主要原因之一。由于新型抗生素研發(fā)的相對(duì)滯后及臨床上常出現(xiàn)抗生素運(yùn)用的不當(dāng),該菌耐藥性菌株日益增多,因此疫苗對(duì)防治感染的作用越來(lái)越重要。目前針對(duì)肺炎鏈球菌的疫苗應(yīng)用較多的是第一代23價(jià)肺炎多糖疫苗和第二代7價(jià)肺炎多糖一蛋白偶聯(lián)疫苗,前者主要問(wèn)題在于單純多糖是T細(xì)胞非依賴性抗原,對(duì)免疫系統(tǒng)發(fā)育不完善的2歲以下嬰幼兒以及老年人的保護(hù)性弱;而多糖蛋白偶聯(lián)疫苗的莢膜多糖只有7種血清型,數(shù)量有限,對(duì)肺炎高發(fā)人群保護(hù)作用小,且生產(chǎn)成本高、不適合在發(fā)展中國(guó)家大量使用,并有可能引起臨床上流行肺炎球菌血清型的改變。新型核酸疫苗技術(shù)近年來(lái)引起了防治肺炎球菌疾病研究的重視,對(duì)于肺炎球菌核酸疫苗的研究在動(dòng)物中已得到開(kāi)展,以誘導(dǎo)抵制不同蛋白抗原免疫應(yīng)答為目的的核酸疫苗已在疾病模型中顯示了它們的保護(hù)效果。然而,核酸疫苗目前要解決的主要問(wèn)題是其誘導(dǎo)的特異性免疫應(yīng)答水平不足以滿足預(yù)防和治療性疫苗的要求,表現(xiàn)為核酸疫苗對(duì)小動(dòng)物較免疫效果好,但對(duì)人類或靈長(zhǎng)類動(dòng)物無(wú)效或者誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答太低缺乏免疫保護(hù)或治療作用。 肺炎球菌溶血素(Pneumolysin,PN)是肺炎球菌產(chǎn)生的最主要毒素之一,是肺炎球菌產(chǎn)生的唯一能破壞宿主防御、補(bǔ)體和免疫應(yīng)答的毒力蛋白,所有不同血清型肺炎鏈球菌的PN分子構(gòu)造或抗原性相似,相互之間有交叉免疫保護(hù)作用,因而成為肺炎球菌核酸疫苗的理想候選基因之一。其鄰近羧基端的11個(gè)氨基酸序列為細(xì)胞毒性所必需,為保證疫苗的安全性,本研究在構(gòu)建核酸疫苗時(shí)切去肺炎球菌溶血素基因羧基端33個(gè)核苷酸以去除其溶血活性,并采用體內(nèi)電轉(zhuǎn)染初免結(jié)合蛋白質(zhì)加強(qiáng)的免疫策略以增強(qiáng)核酸疫苗在小鼠和非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物體內(nèi)的免疫原性。 根據(jù)Walker等1987年報(bào)道的肺炎球菌溶血素基因序列(GenBank accessionno.X52474),設(shè)計(jì)引物,運(yùn)用PCR技術(shù)從肺炎球菌基因組DNA中擴(kuò)增出肺炎球菌溶血素全長(zhǎng)基因(pn)和切去羧基端33個(gè)核苷酸的基因(pnd)。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切、回收,將pn插入到pET-28a中構(gòu)建成pET-pn重組體,將pnd插入到pET-21a載體中,構(gòu)建成ET-pnd重組體,經(jīng)鑒定后將pET-pn轉(zhuǎn)化進(jìn)宿主菌JM109(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中,將pET-pnd轉(zhuǎn)化進(jìn)BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中,IPTG誘導(dǎo)表達(dá),通過(guò)超聲波破菌,用固相Ni-NTA樹(shù)脂作親和吸附純化。經(jīng)SDS-PAGE、溶血活性測(cè)定和Western-blotting檢測(cè)證實(shí),蛋白表達(dá)的產(chǎn)物相對(duì)分子量為52KDa和50KDa,純化后的蛋白純度達(dá)到90%以上。PND蛋白完全喪失溶血活性,但抗原性不受影響,完好保留了原PN蛋白質(zhì)的抗原表位,可用作檢測(cè)試驗(yàn)和核酸疫苗加強(qiáng)免疫的蛋白質(zhì)抗原。 再將pn和pnd基因插入到pVAX1載體中,構(gòu)建Pn和Pnd重組質(zhì)粒。將重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌DH5α宿主細(xì)胞,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和DNA測(cè)序分析鑒定正確后大量抽提質(zhì)粒DNA,并去除內(nèi)毒素,配制Pn和Pnd核酸疫苗。 將構(gòu)建好的核酸疫苗對(duì)小鼠和恒河猴進(jìn)行DNA免疫。8周齡雌性Balb/c小鼠隨機(jī)分組,每組5只。對(duì)照組注射pVAX1空質(zhì)粒,實(shí)驗(yàn)組小鼠每只兩側(cè)脛骨前肌內(nèi)注射10μg肺炎球菌Pn或Pnd核酸疫苗,注射后立即于注射部位用活體基因?qū)雰x進(jìn)行體內(nèi)電轉(zhuǎn)染。每隔兩周免疫1次,共3次,為初免。第3次核酸疫苗免疫后2周,用各核酸疫苗相應(yīng)的純化PN或PND蛋白質(zhì)抗原進(jìn)行加強(qiáng)免疫,每只小鼠腹腔注射50μg不加佐劑的抗原蛋白。在第3次DNA免疫和蛋白質(zhì)抗原加強(qiáng)免疫后的第10天采血,分離血清作免疫印染或ELISA間接法檢測(cè)血清特異性抗體及其效價(jià)。結(jié)果顯示小鼠肌肉內(nèi)注射10微克核酸疫苗加電轉(zhuǎn)染能誘導(dǎo)出特異性抗體免疫應(yīng)答。采用相應(yīng)蛋白加強(qiáng),小鼠血清特異性抗體的幾何平均滴度比加強(qiáng)前提高約4倍。4-6歲(4-5公斤)恒河猴隨機(jī)分為2組,每組2只,采用TwinInjector注射裝置,分別肌肉注射Pn和Pnd核酸疫苗0.5mg/只,每4周免疫1次,共3次,末次免疫14天后用相應(yīng)的PN或PND蛋白腹腔接種進(jìn)行加強(qiáng)免疫(500μg/只),在第3次免疫或蛋白加強(qiáng)后第10天分別采血,用ELISA間接法測(cè)其效價(jià)。結(jié)果顯示給恒河猴肌肉內(nèi)注射0.5mg核酸疫苗加電轉(zhuǎn)染能誘導(dǎo)出特異性抗體免疫應(yīng)答,采用相應(yīng)蛋白加強(qiáng),恒河猴血清特異性抗體的幾何平均滴度比加強(qiáng)前提高了約4倍。因此,采用電轉(zhuǎn)染技術(shù)結(jié)合DNA初免-加強(qiáng)免疫的策略,能顯著增強(qiáng)肺炎球菌溶血素核酸疫苗在小鼠和恒河猴體內(nèi)的特異性免疫應(yīng)答。 通過(guò)本課題,在國(guó)內(nèi)首次制備成功適合發(fā)展中國(guó)家的第三代肺炎鏈球菌溶血素核酸疫苗,并首次在國(guó)際上采用靈長(zhǎng)類動(dòng)物模型來(lái)驗(yàn)證肺炎球菌溶血素核酸疫苗的免疫原性和免疫保護(hù)效果,旨在為增強(qiáng)此疫苗在大動(dòng)物體內(nèi)的免疫效果提供新方法,為研制開(kāi)發(fā)用于臨床的肺炎球菌核酸疫苗奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號(hào)】：R392

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2405565