【摘要】： 肺炎鏈球菌是引起肺炎、腦膜炎、中耳炎的主要致病菌,是引起世界范圍嬰幼兒、老年人、免疫缺陷個體感染的主要原因之一。由于新型抗生素研發(fā)的相對滯后及臨床上常出現(xiàn)抗生素運用的不當,該菌耐藥性菌株日益增多,因此疫苗對防治感染的作用越來越重要。目前針對肺炎鏈球菌的疫苗應用較多的是第一代23價肺炎多糖疫苗和第二代7價肺炎多糖一蛋白偶聯(lián)疫苗,前者主要問題在于單純多糖是T細胞非依賴性抗原,對免疫系統(tǒng)發(fā)育不完善的2歲以下嬰幼兒以及老年人的保護性弱;而多糖蛋白偶聯(lián)疫苗的莢膜多糖只有7種血清型,數(shù)量有限,對肺炎高發(fā)人群保護作用小,且生產(chǎn)成本高、不適合在發(fā)展中國家大量使用,并有可能引起臨床上流行肺炎球菌血清型的改變。新型核酸疫苗技術近年來引起了防治肺炎球菌疾病研究的重視,對于肺炎球菌核酸疫苗的研究在動物中已得到開展,以誘導抵制不同蛋白抗原免疫應答為目的的核酸疫苗已在疾病模型中顯示了它們的保護效果。然而,核酸疫苗目前要解決的主要問題是其誘導的特異性免疫應答水平不足以滿足預防和治療性疫苗的要求,表現(xiàn)為核酸疫苗對小動物較免疫效果好,但對人類或靈長類動物無效或者誘導的免疫應答太低缺乏免疫保護或治療作用。 肺炎球菌溶血素(Pneumolysin,PN)是肺炎球菌產(chǎn)生的最主要毒素之一,是肺炎球菌產(chǎn)生的唯一能破壞宿主防御、補體和免疫應答的毒力蛋白,所有不同血清型肺炎鏈球菌的PN分子構(gòu)造或抗原性相似,相互之間有交叉免疫保護作用,因而成為肺炎球菌核酸疫苗的理想候選基因之一。其鄰近羧基端的11個氨基酸序列為細胞毒性所必需,為保證疫苗的安全性,本研究在構(gòu)建核酸疫苗時切去肺炎球菌溶血素基因羧基端33個核苷酸以去除其溶血活性,并采用體內(nèi)電轉(zhuǎn)染初免結(jié)合蛋白質(zhì)加強的免疫策略以增強核酸疫苗在小鼠和非人靈長類動物體內(nèi)的免疫原性。 根據(jù)Walker等1987年報道的肺炎球菌溶血素基因序列(GenBank accessionno.X52474),設計引物,運用PCR技術從肺炎球菌基因組DNA中擴增出肺炎球菌溶血素全長基因(pn)和切去羧基端33個核苷酸的基因(pnd)。對PCR產(chǎn)物進行酶切、回收,將pn插入到pET-28a中構(gòu)建成pET-pn重組體,將pnd插入到pET-21a載體中,構(gòu)建成ET-pnd重組體,經(jīng)鑒定后將pET-pn轉(zhuǎn)化進宿主菌JM109(DE3)感受態(tài)細胞中,將pET-pnd轉(zhuǎn)化進BL21(DE3)感受態(tài)細胞中,IPTG誘導表達,通過超聲波破菌,用固相Ni-NTA樹脂作親和吸附純化。經(jīng)SDS-PAGE、溶血活性測定和Western-blotting檢測證實,蛋白表達的產(chǎn)物相對分子量為52KDa和50KDa,純化后的蛋白純度達到90%以上。PND蛋白完全喪失溶血活性,但抗原性不受影響,完好保留了原PN蛋白質(zhì)的抗原表位,可用作檢測試驗和核酸疫苗加強免疫的蛋白質(zhì)抗原。 再將pn和pnd基因插入到pVAX1載體中,構(gòu)建Pn和Pnd重組質(zhì)粒。將重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進大腸桿菌DH5α宿主細胞,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和DNA測序分析鑒定正確后大量抽提質(zhì)粒DNA,并去除內(nèi)毒素,配制Pn和Pnd核酸疫苗。 將構(gòu)建好的核酸疫苗對小鼠和恒河猴進行DNA免疫。8周齡雌性Balb/c小鼠隨機分組,每組5只。對照組注射pVAX1空質(zhì)粒,實驗組小鼠每只兩側(cè)脛骨前肌內(nèi)注射10μg肺炎球菌Pn或Pnd核酸疫苗,注射后立即于注射部位用活體基因?qū)雰x進行體內(nèi)電轉(zhuǎn)染。每隔兩周免疫1次,共3次,為初免。第3次核酸疫苗免疫后2周,用各核酸疫苗相應的純化PN或PND蛋白質(zhì)抗原進行加強免疫,每只小鼠腹腔注射50μg不加佐劑的抗原蛋白。在第3次DNA免疫和蛋白質(zhì)抗原加強免疫后的第10天采血,分離血清作免疫印染或ELISA間接法檢測血清特異性抗體及其效價。結(jié)果顯示小鼠肌肉內(nèi)注射10微克核酸疫苗加電轉(zhuǎn)染能誘導出特異性抗體免疫應答。采用相應蛋白加強,小鼠血清特異性抗體的幾何平均滴度比加強前提高約4倍。4-6歲(4-5公斤)恒河猴隨機分為2組,每組2只,采用TwinInjector注射裝置,分別肌肉注射Pn和Pnd核酸疫苗0.5mg/只,每4周免疫1次,共3次,末次免疫14天后用相應的PN或PND蛋白腹腔接種進行加強免疫(500μg/只),在第3次免疫或蛋白加強后第10天分別采血,用ELISA間接法測其效價。結(jié)果顯示給恒河猴肌肉內(nèi)注射0.5mg核酸疫苗加電轉(zhuǎn)染能誘導出特異性抗體免疫應答,采用相應蛋白加強,恒河猴血清特異性抗體的幾何平均滴度比加強前提高了約4倍。因此,采用電轉(zhuǎn)染技術結(jié)合DNA初免-加強免疫的策略,能顯著增強肺炎球菌溶血素核酸疫苗在小鼠和恒河猴體內(nèi)的特異性免疫應答。 通過本課題,在國內(nèi)首次制備成功適合發(fā)展中國家的第三代肺炎鏈球菌溶血素核酸疫苗,并首次在國際上采用靈長類動物模型來驗證肺炎球菌溶血素核酸疫苗的免疫原性和免疫保護效果,旨在為增強此疫苗在大動物體內(nèi)的免疫效果提供新方法,為研制開發(fā)用于臨床的肺炎球菌核酸疫苗奠定了基礎。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：復旦大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2008
【分類號】：R392

【共引文獻】

相關期刊論文 前10條

1 周永東,張明程,蔣琳,沈心亮,畢勝利;粘膜免疫戊型肝炎試驗性疫苗的研究[J];病毒學報;2005年01期

2 莊漢瀾;董梅;;炭疽免疫預防研究的現(xiàn)狀及動向[J];傳染病信息;2006年02期

3 王少華;畢赤酵母表達系統(tǒng)及其在我國病原生物學領域的應用進展[J];國外醫(yī)學(寄生蟲病分冊);2003年02期

4 徐苗;免疫佐劑作用機理研究進展[J];國外醫(yī)學.預防.診斷.治療用生物制品分冊;2003年02期

5 李麗;丁元廷;;卡介苗穩(wěn)定L型對動物致病性的研究[J];貴州醫(yī)藥;2013年01期

6 胡仁建;蔡家利;劉利;涂漫語;徐濤;杜翠容;羅佳;丁森;;HPV18E7重組質(zhì)粒的構(gòu)建及在大腸桿菌中的表達優(yōu)化[J];重慶醫(yī)學;2013年30期

7 毛記軍;徐殿勝;夏杰;陸兵;;結(jié)核病核酸疫苗純化過程的初步研究[J];華東理工大學學報(自然科學版);2006年11期

8 童巖,邊傳周,鄭純寧;新型免疫佐劑研究進展[J];河南農(nóng)業(yè)科學;2005年07期

9 白靜;任敏;;一些新型免疫佐劑的研究進展[J];河南畜牧獸醫(yī);2006年07期

10 周世力;DNA疫苗的研究進展[J];江漢大學學報;2002年02期

相關會議論文 前2條

1 張?zhí)煨?王秀利;袁野;;DNA疫苗佐劑研究進展[A];2007年全國生化與生物技術藥物學術年會論文集[C];2007年

2 何海蓉;李吉軒;梅忠;何召慶;宋立芹;廖常和;岳建新;楊培豫;劉月煥;林建;;不同來源油佐劑質(zhì)量分析及其制備的禽流感(Re-5株)滅活疫苗免疫效力比較研究報告[A];首屆中國獸藥大會——獸醫(yī)生物制品學、獸醫(yī)微生物學學術論壇論文集（2008）[C];2008年

相關博士學位論文 前10條

1 張德慶;C3d分子佐劑核酸疫苗的構(gòu)建與免疫效果研究[D];山東農(nóng)業(yè)大學;2011年

2 陳克研;豬血凝性腦脊髓炎免疫層析檢測試紙及其滅活疫苗的研制[D];吉林大學;2011年

3 劉曉宇;帶有Tuftsin的分支狀流感病毒M2e多肽疫苗的研究[D];中國疾病預防控制中心;2011年

4 師東方;豬輪狀病毒和傳染性胃腸炎病毒核酸免疫的研究[D];東北農(nóng)業(yè)大學;2002年

5 吳紹強;雞球蟲核酸疫苗的研究[D];中國農(nóng)業(yè)大學;2003年

6 徐薇;新型chitosan-DNA疫苗誘生CVB3特異粘膜免疫及其預防病毒性心肌炎的研究[D];復旦大學;2003年

7 劉丹;人參愈傷組織源性細胞系表達乙肝病毒表面抗原的研究[D];吉林大學;2004年

8 肖少波;偽狂犬病毒gC基因“自殺性”DNA疫苗及VP22蛋白轉(zhuǎn)導的免疫增強效應研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學;2004年

9 孔慶波;轉(zhuǎn)移因子增強犬細胞免疫功能的作用機理研究[D];西北農(nóng)林科技大學;2005年

10 曹慧穎;人胸腺素α1基因及乳鐵蛋白基因在番茄中表達的研究[D];中國農(nóng)業(yè)科學院;2005年

相關碩士學位論文 前10條

1 周曉芬;金黃色葡萄球菌腸毒素B作為免疫佐劑的研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學;2010年

2 任靜曉;炭疽桿菌A16R免疫蛋白質(zhì)組學的研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學;2010年

3 周勇;草魚出血病轉(zhuǎn)基因植物疫苗表達載體的構(gòu)建[D];華中農(nóng)業(yè)大學;2010年

4 陳德峰;細胞白介素2基因佐劑對乙型肝炎疫苗效果影響的研究[D];吉林大學;2011年

5 劉景福;布魯菌新型亞單位疫苗BP26的動物免疫評價[D];福建醫(yī)科大學;2011年

6 楊明鋒;致奶牛乳房炎金葡菌亞單位疫苗與原核表達牛IL-6的佐劑效果研究[D];石河子大學;2010年

7 張千里;HBcAg展示技術表達含有礁珊瑚熒光蛋白的病毒樣顆粒[D];上海交通大學;2011年

8 高志勇;結(jié)核分枝桿菌體內(nèi)誘導抗原初步研究[D];鄭州大學;2003年

9 袁萬哲;仔豬大腸桿菌病K88-K99-987P-F41四價亞單位疫苗的研制[D];南京農(nóng)業(yè)大學;2004年

10 吳勝昔;抗豬SIgA、IgM單克隆抗體及其酶標記抗體的研制[D];南京農(nóng)業(yè)大學;2004年

，

本文編號：2405565